细胞生物的学技术

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1、实用标准文案第二章细胞生物学技术—、光学显微镜（一）普通光学显微镜（略）（二）荧光显微镜Fluorescencemicroscope用于观察能激发出荧光的结构。免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。功用：用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描；能显示细胞样品的立体结构；分辨力是普通光学显微镜的3倍；能扫描不同层次，形成立体图像。（三）激光共聚焦扫描显微境1、特点:高分辨率（0.18µm）、高灵敏度、高放大倍数2、在生物医学中的应用（主要）（1）细胞、组织的三维重建（2）对活细胞进行无损伤的适时观察分析（各种细胞器、核酸、

2、蛋白质等物质）（3）细胞内钙离子、pH值和其他离子动态分析（四）暗视野显微镜darkfieldmicroscope聚光镜中央有挡光片，视野背景是黑的，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的。可观察4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。（五）微分干涉差显微镜（DIC）1952年Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。（九）当代显微镜的发展趋势采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、暗视野、

3、DIC、摄影装置于一体；自动化与电子化。二、电子显微镜（一）透射电子显微镜分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍；用于观察超微结构（小于0.2µm）。（1）超薄切片超薄切片厚度仅50nm左右，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。（2）负染技术用重金属盐(如磷钨酸)染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。（3）冰冻蚀刻f

4、reeze-etching亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露断面结构。向断面喷涂一层蒸汽铂和碳。然后将组织溶掉，把铂和碳的膜剥下来，此膜即为复膜。断面的三种处理方法：蚀刻（etching）、不蚀刻（noetching）、深度蚀刻（deepetching）精彩文档实用标准文案（二）扫描电子显微镜主要用于观察样品（细胞）的表面形貌（三）扫描隧道显微镜分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.01nm。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。三、显微操作技术是在倒置显微镜下利

5、用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。第二节生物化学与分子生物学技术一、细胞化学技术在保持细胞结构完整的条件下，通过化学反应对细胞内各种成分进行定性、定位和定量的研究，以及了解这些成分在细胞活动过程中的动态变化的技术。原理：利用某些化学物质可与细胞内某种成分发生化学反应，而在局部范围内形成有色沉淀或电子密度高的物质。可对蛋白质（酶）、核酸、碳水化合物等进行定性、定位、定量研究。二、荧光细胞化学与免疫荧光荧光细胞化学：自发或激发荧光免疫荧光：利用抗体

6、同特定抗原专一结合的原理，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。免疫荧光法：如异硫氰酸荧光素、罗丹明等。酶标免疫法：如辣根过氧化物酶。三、放射自显影术用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。14C半衰

7、期为5730年，3H为12.5年。四、分子杂交技术具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。（一）原位杂交（insituhybridization）。用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。（二）Southern杂交精彩文档实用标准文案是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA

8、片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。五、PCR技术1983KaryMullis发明1985开始有文章发表1993获诺贝尔奖广泛用于分子生物学研究领域PCR技术的原理PCR即：polymerasechainre