分子细胞生物学——细胞生物学研究技术

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1、第二章细胞生物学研究技术李莲军博士云南农业大学动物科技学院2003.9-2010.9生命科学是实验科学，它的很多成果都是通过实验才得以发现和发展的。许多细胞生物学的重要进展以及新概念的形成，往往来自新技术的应用。因此，方法上的突破，对于理论和应用上的发展具有巨大的推动作用。第一节显微镜技术第二节细胞成分分析技术第三节细胞组分分离技术第四节　细胞分选技术第五节细胞工程技术第六节　分子生物学技术学习内容一、光学显微镜技术(lightmicroscopy)第一节显微镜技术二、电子显微镜技术(electronmicroscopy)观察细胞及其组分的形态和结构

2、。显微镜成像三要素:①照明系统，②被观察的样品，③聚焦和成像的透镜系统一、显微镜成像基本原理在光学显微镜中，照明系统是可见光，使用的是玻璃透镜系统，可直接通过目镜观察镜像。在电子显微镜中，照明系统为电子束，使用电磁透镜，通过荧光屏观察样品的镜像。0.61λ分辨率DN.sinα/2=λ:光源波长;α:物镜镜口角;N:介质折射率显微镜的分辨能力肉眼：0.2mm;光镜：0.2um;电镜：0.2nm二、常用光学显微镜普通光学显微镜倒置显微镜(invertedmicroscope)荧光显微镜(fluorescencemicroscope)相差显微镜(phase

3、-contrastmicroscope)微分干涉相差显微镜(differentialinterferencecontrastmicroscope,DIC)暗视野显微镜(darkfieldmicroscope)激光共焦扫描显微镜(laserconfocalmicroscope)倒置显微镜组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。相差显微镜在结构上进行了特别设计，尤其是光学系统，将光程差或相位差转换成振幅差，主要用于观察体外培养中活细胞的形态结构。利用紫外线发生装置(如弧光灯、水银灯等)发出强烈的紫外线光源，用于

4、观察细胞中有自发荧光、诱发荧光或经荧光染料标记的结构。荧光显微镜特点是：a光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；b有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。微分干涉显微镜偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器。暗视野显微镜暗视野显微镜(darkfieldmicroscope)的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至

5、4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。暗视野显微镜主要观察的是物体的轮廓，不分辨内部的微细构造，适合于观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和霉菌等。可对细胞内部非侵入式光学断层扫描成像，可进行一系列亚细胞水平的结构和功能研究。激光共聚焦扫描显微镜扫描电子显微镜Scanningelectronmicroscopy，SEM透射电子显微镜Transmissionelectronmicroscopy，TEM三、电子显微镜电子显微镜观察到的结构称超(亚)微结构，可放大几万倍至几十万倍。扫描隧道显微镜Scanningtunnelingm

6、icroscope，STM观察细胞内部超微结构，分辨率0.2nm。用电子束穿透标本，经电磁场的会聚和放大后在荧光屏上显像或将影像投射到照相底片。由于电子束穿透力弱，故经固定后的电镜标本需制成超薄切片(50～80nm)，并用重金属盐如柠檬酸铅和醋酸铀等染色。标本制备：①固定(戊二醛等)②包埋(环氧树脂)③切片(50-80nm)④染色(醋酸铀和柠檬酸铅等重金属盐)。透射电镜术扫描电镜术用于观察细胞表面的立体细微结构。需将小块组织经固定、脱水、干燥后，在其表面喷镀薄层碳膜或金属膜。图像清晰，富有立体感。仪器设备使用注意事项使用前必须认真阅读“说明书”，了解

7、其工作原理和性能，按照“说明书”的要求进行操作，或在技术人员的指导下操作。第二节细胞组分的分析方法一、细胞化学技术二、免疫细胞化学技术三、核酸杂交技术四、放射自显影技术一、细胞化学技术主要用于显示细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等。利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。如用过碘酸—Schiff反应检测多糖，用脂溶性染料显示脂类，用酶化学染色显示某种酶，用孚尔根反应显示DNA。二、免疫细胞化学技术是应用免疫学原理，采用标记的抗原或抗体，通过抗原与抗体的特异性结合

8、，然后用显微镜观察标记物，显示细胞内的抗体或抗原(肽或蛋白质等)的分布部位及相对含量。常用的标记物有辣根过氧