卵巢癌细胞系ovcar3中侧群细胞的分离鉴定及生物学特性的研究

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3、癌和子宫体癌，但卵巢癌的病死率是所有妇科肿瘤中最高的。其临床症状不典型，发病部位隐蔽，易于转移及广泛播散。卵巢癌进行剖腹探查术中发现肿瘤局限于卵巢的仅占30％，大多数已扩散到子宫双侧附件，大网膜及翁腔各器官，所以至今卵巢癌在诊断和治疗上仍是一大难题，而且治疗后极易复发。经以手术为主的综合治疗以后5年存活率仍然徘徊在30％左右。这一状况近十年来未能改善，对妇女生命造成严重威胁，因此探索新的治疗策略显得极为迫切。近年来随着对肿瘤研究的不断深入，逐渐形成了肿瘤干细胞理论。人们发现肿瘤细胞中也存在等级现象，并且认识到仅少量肿瘤细胞在恶性肿瘤

4、发展过程中起到干细胞作用，它们具有不断地自我更新和分化的能力，可以维持恶性肿瘤组织的不断生长和转移，还可以分化成各种肿瘤细胞和非肿瘤细胞。但是肿瘤组织中其余大部分细胞在经过短暂的分化后，即便没有化疗药物的作用也会最终走向凋亡或死亡。摘要的研究越来越多，并在多种实体肿瘤中证实了肿瘤干细胞的研究对认识卵巢癌的发病机制、早期诊断以及根治向。细胞是研究肿瘤干细胞的首要问题，但是如果缺乏特异的表面标记物，肿瘤干细胞的分离鉴定就变成一个难题。侧群细胞(Sidepopulationcell，SPcell，SP细胞)是利用DNA荧光染料Hoechs

5、t33342和流式细胞技术发现的特殊细胞亚群，能通过ABC转运蛋白将荧光染料Hoechst33342泵出细胞而呈弱染状态，并因此而得名。侧群细胞可能是一种特殊类型的干细胞，具有自我更新、多向分化等一系列干细胞的生物学特征。至今人们已经在多种实体肿瘤中分离得到了侧群细胞。当缺乏干细胞特异标记的情况下，SP细胞分选和分析成为研究肿瘤干细胞的一种实用而重要的方法。最近的研究发现，肿瘤干细胞的另一重要特征是它们具有间质细胞的特性，它们容易出现表皮细胞向间质细胞转化(Epithelialmesenchymaltransformation，EM

6、T)。EMT现象是肿瘤发生侵袭和转移的第一步，也是最重要的一步。阻断肿瘤干细胞的EMT特性，有可能预防肿瘤的侵袭和转移。本研究利用SP细胞的弱染特性将OVCAR．3细胞系中的SP细胞分选出来，并对其生物学特性进行研究，为探索以肿瘤干细胞理论为基础的新的卵巢癌治疗策略提供实验依据。研究方法：本研究中，首先用免疫细胞化学方法分析了干细胞相关基因Oct3／4在OVCAR．3细胞中的表达。随后将生长状态良好的OVCAR．3细胞经Hoechst33342染色后进行流式细胞仪分选，通过对Hoechst33342浓度和染色时间的调整对SP方法进行

7、条件优化。对比维拉帕米抑制实验在流式细胞仪上设门，分别收集荧光阳性的NSP细胞和荧光阴性的SP细胞，研究它们生物学性状的差异，包括将分选后的两个亚群的细胞分别接种到六孔板中，进行克隆形成实验，比较两个亚II摘要群细胞克隆形成能力是否存在差异：分别提取两个亚群细胞的总RNA，进行real．timePCR，比较两个亚群细胞中干细胞相关基因Oct3／4和EMT相关基因Vimentin、E．cadherin、N．cadherin等的表达差异；用无血清培养基分别培养分选的SP细胞年INSP细胞，观察它们的形态变化；用不同剂量的X射线照射分选的

8、SP细胞幂INSP细胞，比较其对X射线的抵抗能力。结果：免疫细胞化学结果显示，OVCAR．3细胞系中的一小群细胞表达Oct3／4蛋白，但与阳性对照精原细胞癌中0ct3／4蛋白的表达相比，OVCAR．3细胞中Oct3／4蛋白的表达非常微