spred-2在cona诱导的小鼠肝炎中的保护作用

《spred-2在cona诱导的小鼠肝炎中的保护作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、大连医科大学硕士学位论文Spred-2在ConA诱导的小鼠肝炎中的保护作用姓名：曹晨申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：关宏伟201106Spred-2在ConA诱导的小鼠肝炎中的保护作用硕士生姓名：曹晨指导教师：关宏伟教授专业名称：病理学与病理生理学摘要引言：T细胞在多种肝脏疾病的发病过程中具有重要作用，如病毒性肝炎，自身免疫性肝炎，酒精性肝病和非酒精性脂肪肝病等，但是T细胞如何发挥作用及其相关细胞因子的信号调控机制仍不清楚。其中急性乙肝病毒(HBV)的清除和肝细胞的损伤是两个不同过程，HBV清除在肝细胞损伤前就已

2、经完成，当特异性杀伤性T细胞(CTL)的缺乏导致病毒复制不能得到有效控制时，可引起大量非特异性炎性细胞，特别是非特异性CD8+T细胞在多种细胞因子的趋化作用下对肝组织的广泛浸润，这是造成肝组织大面积损伤的基础。为了深入研究T细胞应答在肝脏疾病中的作用机制，选择和应用与人类肝炎发病特征相类似的动物肝炎模型十分必要。注射刀豆蛋白A(ConcanavalinA，ConA)诱发动物肝炎是一个已经建立完善的模型，这种模型的病理特征与人类病毒性肝炎，自身免疫性肝炎和药物性肝炎相似。ConA诱导的肝炎主要通过快速活化多克隆T细胞包括为CD4+T细

3、胞、CD8+T细胞和NKT细胞来实现自身免疫损伤。其特征是血清谷丙转氨酶水平迅速升高，血清中含有大量细胞因子，肝脏出现白细胞浸润，肝细胞坏死和凋亡。在这种由ConA诱导的免疫系统过度活化所引起的肝脏急性损伤模型中，T细胞的激活依赖于Thl细胞因子IFNy及其信号传导通路。研究表明丝裂原活化蛋白激酶(mitogen—activatedproteinkinase，MAPK)信号传递途径在肝脏先天抗病毒防御系统、急性期反应、肝脏损伤与修复中均起着重要作用。Spred(Sprouty相关的蛋白激酶异构体一1(EVH_1)domain)蛋白家

4、族是一组与Sprouty相关的酪氨酸激酶结合蛋白，是重要的负调控因子，能够抑制生长因子诱导的胞外信号调节激酶(extracellularsigna卜regulatedkinase，ERK)的活化从而下调Ras—ERK一姒PK信号通路。鉴于MAPK通路在肝脏生物学中的作用，由此推断Spred可能在T细胞介导的肝脏损伤中发挥重要作用。通过Northern杂交检测小鼠各组织中的mRNA，发现Spred-2在全身各处均有表达，Spred一1仅分布于心、脑、肾、结肠等，而Spred一3特异地表达于脑组织中。课题组之前利用DNA同源重组技术和胚

5、胎干细胞(ES细胞)发育全能性的原理，定点改变小鼠基因组的序列和结构，获得特定基因(基因组)即Spred-2被修饰的遗传性小鼠突变模型。因此本课题将应用基因敲除技术构建的动物模型对Spred-2在T细胞介导的肝脏损伤的调控机制进行深入研究，为肝炎的治疗提供新的思路和启发。目的：探讨Spred-2在ConA诱导的小鼠肝炎中的保护作用。方法：雌性6’8周C57BL／6J(wT)小鼠和Spred一2基因敲除(Spred一2KO)小鼠，单次静脉注射ConA(15mg／kg体重)后，6h、12h、24h麻醉后处死。血浆液氮冻存，肝脏生理盐水冲

6、洗后，一部分液氮冻存，一部分10％中性甲醛固定，另一部分0．25％胶原酶消化后分离肝脏白细胞。生化法测定血清谷丙转氨酶浓度；试剂盒比色法测定caspase一3，8，9含量，ELISA法测定血清IFNY浓度；应用流式细胞仪测定肝脏T细胞和NKT细胞数目；RealtimePCR测定CXCL9／IO，CXCR3受体，Perforin，Fas，TNF—Q，IL-17mRNA水平。结果：ConA注射12小时后，Spred一2K0小鼠肝脏损伤较wT小鼠严重，血清谷丙转氨酶(7476．20±1387．54IU／Lvs．3752．63±803．36

7、IU／L，P<0．05)浓度升高；Caspase-3，-8，-9相对值为(63．78±11．90YS．17．35±4．48，P<0．05；48．21±7．62VS．8．89±1．92，P<0．05；48．07±7．39YS．8．23±2．36，P<0．05)活性增加；血清IFNY(1．89±0．18ng／mlVS．0．81±0．22ng／m1，P<0．05)浓度升高，肝脏IFNY相对值(2．57±0．49VS．1．40±0．25，P<0．05)水平提高：流式细胞术发现，Spred-2KO小鼠肝脏CDS+T细胞数量显著增加(8．41±

8、2．13105／mlVS．5．15±1．18105／m1，P<0．05)，CD4+T细胞和NKT细胞数量与WT小鼠无显著差异；CXCL9／IO，CXCR3受体，Perforin，Fas表达水平提高。结论：1、肝细胞损伤程度在具有Spr