hur通过拮抗内含子中嘧啶富集区的作用调节wt1kts亚型的可变剪接

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1、目录一、摘要1(一)中文摘要1(二)英文摘要4二、正文7(一)前言7(二)材料和方法91．材料．．92．方法12(三)结果．．20(四)讨论．．29(五)结论．．30(六)参考文献．．3l三、综述34(一)综述34(二)参考文献．39四、攻读学位期间发表文章情况45五、致谢46万方数据大连医科大学硕士学位论文HuR通过拮抗内含子中嘧啶寓集区的作用调节WTI+／一KTS亚型的可变剪接硕士研究生：李慧指导教师：雷海新教授专业名称：肿瘤学摘要目的：可变剪接是人体蛋白功能多样性的重要来源[1】，人类基因组中超过90％的编码基因表达都存在可变剪接现象【2】。可变剪接往往融mRNA前体中剪接

2、调控元件与特异的RNA结合蛋白相互作用进行调控。根据其位置及其作用，可将剪接调控元件分为外显子或内含子中的剪接增强子或沉默子。之前的研究表明，剪接增强子能够招募SR蛋白而剪接沉默子则更易招募hnRNPs等反式作用因子，抑制或激活对剪接位点的识别【3】。Wilms’tumor1(WTI)基因位于1】q13，一共有10个外显子，编码的蛋白分子量为52—54kD，在C末端含有四个锌指功能区。WTI基因表达中有两个主要可变剪接事件，其中+KTS和一KTS是由于第九外显子末端存在两个可变5’剪接位点而导致在WTl蛋白的第三和第四锌指结构之间插入或缺失三个氨基酸KTS[2】。+／一KTS在蛋

3、白序列上仅相差3个氨基酸，在功能上既有很多相似之处，但又有各自独特的功能。这两种亚型在心脏、脾脏、肾上腺的发育中具有相似作用，而在肾脏发育，性别分化等过程中发挥不同作用。研究表明．--KTS亚型的主要功能是作为转录因子，而+KTS亚型主要参与转录后的RNA加工过程【4，5】。与这两种蛋白亚型的不同功能相对应的是它们在细胞核中的分布也不同，--KTS亚型在核中呈现较为均匀的分布，而+KTS娅型则主要分布在与RNA剪接功能相关的核斑区[6】。进一步研究表明在乳腺上皮细胞中WTI--KTS亚型起着肿瘤抑制作用，它能使p2l表达上升，并导致细胞增殖减缓，细胞周期停滞在G2期；而+KTS亚

4、型表现出促进肿瘤进程的功能，它对p21的表万方数据大连医科大学硕士学位论文达和增殖没有明显影响，但导致上皮一问质转化(EMT)并伴随着E．caderin和vimentin的表达变化[7】。然而，-I-KTS和一KTS可变剪接的调控机制尚不清楚，本研究的目的在于对wTl的转录后调控机制进行深入研究，并初步探讨+KTS和一KTS亚型发挥不同作用的机理，为转化医学提供进一步的理论依据。方法：(1)建立分离wTl+／一KTs亚型的方法。从Hela和293T细胞中提取总RNA，并利用RT．PCR技术检测细胞内源性wTI-t-／一KTS亚型的表达量。(2)定位并验证顺式作用元件对+／一KTs

5、亚型可变剪接的调控作用。主要采用序列删除来定位调控+／一KTS可变剪接的顺式作用元件，顺式元件定位后用序列替换进一步验证顺式元件对可变剪接的调控作用。(3)纯化并鉴定调控可变剪接的反式作用因了。利用Biotin—streptavidin亲和纯化技术纯化+KTS和--KTS亚型特异蛋白复合物并通过质谱分析得出其主要组分。通过RNARIP实验进一步验证反式作用因子与顺式作用元件有相互作用。(4)在报告基因水平上筛选并验证反式作用因子对十／一KTS可变剪接的调控作用。克隆候选反式作用因子，利用瞬时共转染技术将候选基因和wTl报告基因转染到HeLa细胞中，利用RT—PCR检测不同亚型的相

6、对表达量，筛选出对+／～KTs可变剪接有明显调控作用的剪接因子HuR。(5)在细胞内源性表达水平上进行验证反式作用因子对十／一KTS可变剪接的调控作用。构建稳转表达HuR的细胞株，用RT．PCR检测反式作用因子HuR在表达升高时是否能影响细胞内源性wTl+／一KTs亚型的表达。(6)利用RNAi技术敲低细胞中HuR的表达，检测细胞内源性WTl+／一KTS皿型的表达。结果t(1)wTl第九内含子中的一段嘧啶富集区对于+KTS亚型的表达至关重要，删除这一序列导致一KTs的比例从29％上升到93％。(2)这段嘧啶富集序列与多种剪接因子相互作用。(3)HuR与这段嘧啶富集序列相互作用并在

7、报告基因水平促进一KTs亚型的产生。(4)遥表达HuR促进一KTS亚型的内源性表达。(5)敲低HuR抑制--KTS皿型的内源性表达。2万方数据大连医科大学硕士学位论文结论：本研究中，我们通过删除或部分替换WTl第9内含子中的一段富含嘧啶区域Tn发现--KTS亚型表达升高，表明其对+KTS亚型的产生具有重要作用。利用亲和纯化结合质谱分析得出许多结合于这一序列上的剪接因子。在报告基因和细胞内源性表达双重水平上验证，HuR是能够促进一KTS弧型表达的反式作用因子。研究表明，HuR通过结