细胞培养及抗肿瘤药物筛选

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1、细胞培养及抗肿瘤药物筛选博哥（屮山大学化学与化学工程学院，广州510275）一引言随着分子生物学和细胞生物学的崛起，为了在活细胞屮研究也命现象，细胞培养方法得到了广泛的发展和戍用。细胞培养的突出优点，是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响。W为人工培养条件易于改变，并能得到严格的控制，冇利于单W子分析。另外，细胞培养还便于我们对细胞生长、发育过程的观察，讨以用显微镜直接观察亦nJ应用显微缩时电影技术记泌其进程。因而，细胞培养足探索和解释细胞zl▲:命活动规律的一种简而易行的技术。然而，细胞培养方法也有其局限

2、性，巾于培养的细胞生活在脱离了机体的复杂的环境条件下,其生态环境和细胞之间的相互欠系都改变了，W此，其细胞生物学性质必然也会发生某些改变。所以在人工培养条件下观察到的结果难于正确反映细胞或组织在机体rt部的状况。这一点是我们在应用此技术进行研究时应该注意的。本实验采川的培养基由合成培养基、小牛血淸配和双抗制而成。实验对Hela细胞进行了复苏、传代培养、观察不同状态下的Hela细胞，并川MTT法测定8种药物的抗癌作川。二、实验原理1.培养基的配制组织培养使用的培养基一般是山合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出饵，它是根据细

3、胞生长的需耍按一定配方制成的粉状物质。其主耍成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液和似。小牛血淸含有一走的营养成分，更重要的足它含有细胞生松所必须的生松因子、激索、粘附因子等，这是合成培养基所无法替代的。此外它还能屮和冇毐物质的毐性。故一般体外培养细胞时要加入一定量的小亇血淸（10%-20%）。在培养液配制后，培养液内常加适虽抗傳索，以抑制可能存在的细傳的生长。通常足青霉素和链霉素联合使川（双抗）。培养液内青霉素、链霉素最终使川浓度为每毫升100单位。2.细胞的冻存与复苏细胞低温

4、冷冻贮存足细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。当细胞冷到零度以下，可以产生以K变化：细胞器脱水，细胞屮可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，吋使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰品：相反。结敁就大，大结品会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，0的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的巫结晶。1.细胞传代培养(消化法)传代培养是组织培养常规保种方法之，也是儿乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶屮长满后就耑要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这

5、一过程就叫传代。传代培养nJ*获得大虽细胞供实验所需。传代要在严格的无傳条件下进行，每一步都需要汄真仔细的无傳操作。贴壁牛.长细胞采川酶消化法传代，常川的消化液冇0.25%的胰蛋D酶液。2.噻唑蓝实验方法(MTT法)测定药物的抗癌作用叫氣哗IMTT,3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide)是-种能接受窺原了的染料。活细胞线粒体屮与NADP相关的脱氢酶在细胞A吋将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲臜(fomazan),而死的细胞则无此功能。川二甲基业砜

6、洛解甲臜后，在一定波长K川酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。MTT法简单快速、准确，广泛极用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。三、仪器试剂1.仪器与材料CO2培养箱，倒置姑微镜，培养瓶，血球计数板，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%泗精棉球，泗精灯，培奍细胞。2.试剂无离子水,小牛血清,合成培养基(RPMI1640),青霉素，链霉素，NaHCO3、0.25%胰蛋白酶，PBS溶液或Hanks液。操作步骤1.培养基的配制合成培养基冇商品出售，使用加入时适景小牛血清和抗生素1.复苏从液氮(一196°C)中取

7、出冻存管，迅速投入37°(3水浴中，使其融化(1min左^1)。5min内用培养液稀释至原体积的1()倍以上，低速离心lOmin，去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。2.消化与传代(1)倒微镜卜‘观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用溶液37°C下预热。(2)打开超净台的紫外灯照射台面2()min左厶，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机淸洁空气，除去臭氧。(3)点燃泗精灯；取出无蘭试筲，巴上德吸筲和刻度吸管；安上橡皮爻•：过泗精灯火焰略烧C摆在无蘭试管內。(4)将培养川液瓶口川75%酒精消毐，过洒精灯火焰后斜

8、質于洒精灯旁的架子上。(5)倒棹培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3mlPBS溶液或Hanks液洗去残所的旧培养基，或用少暈胰酶涮洗-下。(6)每个人培养瓶加入1ml胰酶，小瓶川量酌减，盖好瓶盖后在倒背显微镜下观察，当细胞收冋突起变圆时