海岛棉乙烯响应因子gberf1-like在抗黄萎病反应中的功能解析

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1、华中农业大学2012级博士学位论文3．1GBERFI．LIKE的序列及生物信息学分析．．183．2GBERFl．LIKE组织表达与诱导表达模式分析213。3棉花、拟南芥转基因系的分子鉴定与接种鉴定一223．4．1转基因棉花与拟南芥系中病程相关蛋白基因(PRs)的表达分析243．4．2转基因棉花木质素合成相关基因的表达分析263．4．3转基因拟南芥木质素合成相关基因的表达分析273．4．4转基因棉花材料接种黄萎病菌后的木质素合成相关基因的表达分析283．4．5转GbERFl．1ike拟南芥材料中接V991后木质素合成相关基因表达分析293．5转GBERFl．LIK

2、E棉花茎的木质素组织化学染色．303．6转GBERFl．LIKE棉花及拟南芥茎中的木质素总量测定．313．7转GBERFl．LIKE棉花茎中的木质素单体组分测定．323．8转GBERFl．LIKE拟南芥茎中的木质素单体组分测定．333．9GHHCTl及ATPAL3启动子与GBERFl．LIKE酵母单杂交分析．．343．10GBERFl．LIKE转录调控木质素合成基因表达的双分子荧光报告分析．353．11超表达GBERFl．LIKE棉花系中对GHHCTl的VIGS分析结果363。12GBERFl．LIKE互作蛋白检测分析404讨论424．1GBERFl．LIKE参

3、与棉花抗病反应424．2GBERFl．LIKE增强棉花、拟南芥对黄萎病菌的抗性434．3棉花、拟南芥中GBERFl．LIKE对木质素单体合成的调节作用存在差别434．4GBERF!．LIKE激活木质素合成而提高对生物逆境的抗性444．5GBERFl．LIKE其它的可能调节作用444．6总结与展望．．45参考文献47附录1所有引物的序列一63附录2木质素合成相关基因启动子中的GCCGCC．BOX元件65致{射．．69II万方数据海岛棉乙烯响应因子GbERFI．ff妇在抗黄萎病反应ep的功能解析缩写名词表缩略词Abbr．中塞垒垡塑竺!茎茎垒丝型垫!—————————

4、—_————————————————————————————_——__-_______--__-_____________--————————————————————————————一一mRNA信使RNAmessengerRNAcDNA互补DNAcomplementaryDNAORF开放阅读框openreadingframeUTR非翻译区untranslatedregionqRT-PCR实时定量PCRquantitativereal·timePCRRNAiRNA干扰RNAintefferenceETH乙烯利EthephonJA茉莉酸JasmonicacidERF

5、乙烯反应因子EthyleneresponsefactorPR病程相关蛋白PathogenesisrelatedproteinDPI接种后天数day(s)postinoculationSSH抑制差减杂交suppressionsubtractivehybridizationLUC双荧光报告分析DualfluorescencereportassayVIGS病毒诱导基因沉默VirusinducedgenesilenceY2H酵母双杂交分析Yeasttwohybridassay万方数据华中农业大学2012级博士学位论文摘要棉花黄萎病是影响棉花生产的主要病害，乙烯信号路径在

6、棉花与黄萎病菌的互作中扮演着重要的角色。明确乙烯在棉花抗黄萎病反应中的调节机制，并调控乙烯信号路径来改良棉花的抗病性对棉花抗病育种和生产具有重要意义。本研究从海岛棉品种“7124”中克隆了乙烯信号路径的一个ERFs类转录因子基因GbERFl．1ike，并对其在棉花抗黄萎病反应中的作用机制开展了研究，取得的主要结果有：1、克隆了GbERFl．1ike的全长序列，其ORF框为537bp，编码179个氨基酸的多肽，含有一个59个氨基酸的ERFs类转录因子保守AP2／ERF结构域。序列聚类显示GbERFl一like与GhERFl(AYl81251．1)，GhERF8(J

7、N656957．1)，TbERF(XM_007035031．1)，GbERF5(JN003808．1)和AtERFl(AB008103)具有较高的同源性。表达分析显示G6ERF『-like在棉花的不同组织都有表达，并能快速响应ET、MeJA处理。相对于感病的陆地棉，GbERFl．1ike在抗病的海岛棉接种黄萎病菌“V991”后上调表达迅速，并且持续的时间长。2、通过农杆菌介导的遗传转化获得了G6ERF，一like在棉花中的超量表达系COV20、COV5与抑制表达系Ci8、Ci6，以及GbERFl．1ike在拟南芥中的超量表达纯系AOVl2、AOV5。接种鉴定分析

8、表明，GbERFl．1i