蛋白质一级结构的测定方法

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1、蛋白质一级结构的测定方法研宂蛋白质的一级结构从确定组成蛋白质的单元结构氨基酸算起，已有150年的悠久历史,直到1955年，Sanger首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺序，为研宄蛋白质的一级结构开辟了道路，这在分子生物学的发展进程中是一个重要突破。目前关于核酸的一级结构研究，由于Sanger等发明了加减法，可以得到了突飞猛进的发展。对此之下，关于蛋白质的一级结构研究进展不如核酸迅速。但随着Edman液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪以及气相色谱、质谱等方法的相继出现，结构分析的速度也显著加快，至今己完成近T•种蛋白质的一级结构分析。目前不仅样品用量减少，而且工作人员也大大

2、减少。当年Sanger分析胰岛素用了整整十年的时间，今天运用自动化仪器，分析一个分子量在10万左右的蛋白质只需要几天，可见新技术的应用和发展对科学发展起的促进作用，蛋白质•一级结构测定方法的综述及专著文献较多，这里只扼要加以概述。蛋白质分子的一级结构测定，概括起來包含多肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以及一S—S—定位等。1.多肽链的分离在测定一个蛋白质的结构以前，首先必须保证被测蛋白质的纯度，使结果准确可靠。其次要了解它的分子量和亚基数，按照其亚基数将蛋白质分成几个多肽链。1)肽链的拆开蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非共价结合两种。要拆开以共价结合的-S

3、-S-连接的多肽链，必须采用的化学处理方法常有：①过甲酸氧化用氧化剂过甲酸断裂-s-s-。这个反应一般在o°c下进行2小时左右，两个s就企部能转变成磺酸基，这样被氧化的半胱氨酸称为磺基丙氨酸。如果蛋白质分子中同吋存在半胱胺酸，那么也会被氧化成磺基丙氨酸。此外甲硫氨酸和色氨酸也可被氧化，从而增加分析的复杂性。②巯基乙醇还原利用还原剂巯基乙醇亦可使蛋白质的-S-S-断裂。当《浓度的巯基乙醇在pH8?条件下室温保温儿小时后，可以使-S-S-定量还原为奎H。与此同时反应系统中还需要有8摩尔脲或6摩尔盐酸胍使蛋白质变性，多肽链松散成为无规则的构型，此吋还原剂就可作用于-S-S

4、-。此反应是可逆的，因此要使反应完全，疏基乙醇的浓度必需在0.1-0.5摩尔。③Cleland试剂的还原作用Cleland's指出二硫赤苏糖醇(dithioerythriotol)及二硫苏糖醇(dithiothriotol)在氧化还原能力上是比较强的试剂，只要0.01摩尔就能使蛋白质的-S-S-还原，反应基本与疏基乙醇相似，且在许多球蛋白反应中，可以不用变性剂。Cleland试剂首先与蛋白质-S-S-形成中间物，反应终了，还原剂被氧化形成一个稳定的六环化合物，蛋白质则被还原。还原蛋白不稳定，SH基极易氧化重新生成-S-S-键。稳定SH基的方法有：(A)烷基化试剂使S

5、H基转变为稳定的硫醚衍生物。如果碘代乙酰胺代替碘代乙酸，其产物S羧氨甲基衍生物不带电荷，磺代乙酸也可与纽氨酸、蛋氨酸和赖氨酸发生反应，但反应条件不同，可通过各种pH及反应时间进行控制。(B)氨乙基化蛋白质分子的儿条肽链若以非共价健结合，则用尿素、盐酸胍等变性剂即可拆幵。蛋白质的多肽链被拆开后，将它分离纯化，一般多用凝胶过滤、离子交换、电泳等方法，兹不赘述。分离纯化后的每条肽链还要进-步分析其末端。2)末端分析其方法较多，这里我们只介绍较常川的几种。(1)N-末端测定A.二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)：1945年Sanger提出此方法，是他的重要贡献之一。DNP-

6、氨基酸用有机溶剂抽提后，通过层析位置可鉴定它是何种氨基酸。Sanger用此方法测定了胰岛素的N末端分别为甘鉍酸及苯丙鉍酸。巳.氰酸盐法：1963年Stank及Smyth介绍了一种测定N—末端的新方法。由于乙内酰脲氨基酸不带电荷，因此可用离子交换层析法将它与游离氨基酸分开，分离所得的乙内酰脲氨基酸再被盐酸水解，重新生成游离的氨基酸，鉴别此氨基酸即可Y解N-末端是何种氨基酸。C.二甲基氨基萘磺酰氯法：1956年Hartley等报告了一种测定N-末端的灵敏方法，采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯，简称丹磺酰氯。它与游离氨基末端作用，方法类似于Sanger的DNFB法，产物是

7、磺酰胺衍生物。丹磺酰链酸具有强烈的黄色荧光。此法优点为灵敏性较高(比FDNB法提高100倍，样品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(对酸水解稳定性较DNP氨基酸高)，可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定。(2)C-末端分析A.肼解法：这是测定C-末端最常用的方法。将多肽溶于无水胼屮，100°C下进行反应，结果羧基末端氨基酸以游离氨基酸状释放，而其余肽链部分与肼生成氨基酸肼。这样羧基末端氨基酸可以采川抽提或离子交换层析的方法将其分出而进行分析。如果羧基末端氨基酸侧链是带有酰胺如天冬酰胺和谷氨酰胺，则肼解时不能产生游离的羧基末端氨基酸。此外肼解时注意避免任何少量