肝动脉灌注化疗抑制肝癌血管生成探究

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1、肝动脉灌注化疗抑制肝癌血管生成探究【摘要】目的：通过对肝癌大鼠进行肝动脉区域灌注化疗，研究其对肿瘤血管生成的影响。方法：建立大鼠肝癌模型后，将造模2周后的肝内荷瘤大鼠18只，按照随机数字表法分为对照组、外周静脉组和肝动脉组各6只。大鼠的5-FU给药剂量为20mg/kg,连续给药4d。化疗结束后第7天摘取肝脏肿瘤，采用免疫组化法检测VEGF和CD34在肝癌组织中的表达。通过VEGF蛋白染色测定积分光密度(IOD),CD34标记血管内皮细胞检测肿瘤内微血管密度(MVD)。结果：对照组VEGF表迗(I0D值)为(46351.48±2926.24

2、)，明显高于外周静脉组(43678.84±2852.76)和肝动脉组(35518.86±2657.16)，且肝动脉组的肝癌VEGF表迗明显低于外周静脉组，差异均有统计学意义(P0.05)。结论：肝动脉灌注化疗能有效抑制肝癌组织VEGF表达，降低MVD，从而抑制肿瘤血管生成。【关键词】肝癌；肝动脉灌注化疗；血管生成；血管内皮生长因子；微血管密度肝动脉灌注化疗是肝癌常用的区域灌注化疗方法，目前常作为肝癌术后治疗和不能切除的晚期肝癌治疗的重要手段。既往的研究提示经肝动脉区域灌注化疗可显著提高肝脏组织药物浓度，同时达到减少药物在外周血和全身其他部

3、位分布［1］。化疗药物抑制肿瘤血管生成是抗肿瘤的重要机制，本文以5-Fu为化疗代表药物，通过对肝癌大鼠进行肝动脉区域灌注化疗，研究其对肿瘤血管生成的影响，现报告如下。1材料与方法1.1试剂与药品兔抗鼠CD34多克隆抗体，VEGF多克隆抗体，武汉博士德有限公司生产。DAB显色试剂盒，SP即用型试剂盒，PBS缓冲液，福州迈新有限公司生产。5-FU由南通精华制药公司提供，批号：070402，规格10mL:0.25g。1.2肿瘤细胞株和实验动物CBRH-7919大鼠肝癌细胞株，中山大学细胞保藏中心提供。（l）BALB/c雄性裸鼠2只，17.1〜1

4、9.6g重，作种鼠皮下接种肿瘤细胞。（2）Wistar雄性大鼠18只，（120±15）g重，作肝内种植肿瘤用。上述动物均为SPF（无特定病原）级，由中山大学动物中心提供。1.3方法1.3.1大鼠肝癌模型的建立将培养好的大鼠肝癌细胞注射于裸小鼠背部皮下，2周后成瘤并取出，切成1mmXlmmXlmm瘤块。然后采用肝内隧道植入法将瘤块接种于Wistar大鼠肝左叶。手术当天始腹腔注射氢化可的松2mg/只/dX5d。术后密切观察造模后荷瘤大鼠的生物学行为、死亡情况等。1.3.2实验分组及给药造模2周后，将18只荷瘤大鼠按照随机数字表法分为对照组（不

5、作任何处理）、外周静脉组（经尾静脉注射）、肝动脉组（经胃十二指肠动脉插管至肝动脉给药），6只/组。大鼠的5-FU给药剂量为20mg/kg,连续给药4d。1.3.3标本采集和处理化疗结束后第7天处死大鼠摘除肝脏肿瘤组织，并置于10%福尔马林中固定后石蜡包埋。将瘤体石蜡标本块切片，厚度约5um。脱蜡后通过微波加热法修复抗原，予免疫组织化学染色。每例标本取2张切片，滴加CD34抗体和VEGF多抗各1滴。1.3.4VEGF检测标本经染色封片后在显微镜下（X200）观察，细胞浆显示棕黄色颗粒为VEGF阳性细胞。每张切片选阳性表达最高的5个高倍视野（

6、X400）照相，采用IPP像分析软件将VEGF蛋白染色的黄色区域作为AOI（areaofinterest）测定分析光密度。取5个视野的积分光密度（I0D）平均值作为该标本的表达强度计量值。1.3.5MVD检测参照Weidner的标准计算各组肿瘤内的微血管密度（MVD）：低倍镜下（X100）寻找切片中棕黄染色密度最高的区域，即为富含血管组织的“热点”区。再在高倍镜下（X400）按染色为棕黄色的内皮细胞均记为一条独立血管的标准计算血管数目。每张切片分别选10个不同高倍视野计算MVD，取平均值。1.4统计学处理采用SPSS13.0软件对所得数据

7、进行统计分析，计量资料用（x土s）表示，比较采用t检验，以PO.05）。3讨论区域灌注化疗可以增加癌灶和靶组织器官的化疗药物浓度和/或降低外周血及其他组织的药物分布，是目前实体肿瘤化疗增效减毒的重要措施和手段之一［1-2］。肝动脉灌注化疗由于具有较明显的药动学优势，常作为肝癌化疗的常用手段［3-4］。原发性肝癌（HCC）是典型的富血供恶性肿瘤，它的发生、发展和转移时刻离不开肿瘤新生血管。肿瘤血管生成是HCC生长和转移的先决条件，如果肿瘤组织没有新生血管支持，则因凋亡和坏死而肿瘤不会大于1〜2mm［5］。而肝癌预后则与癌组织的血管生成调节因

8、子水平和微血管密度（MVD）密切相关［6-7］。VEGF目前被认为是体内最强的一种血管生成因子，其在肝细胞癌中呈高表迗，与肿瘤的生长和预后紧密相关［8-10］。肿瘤微血管密度和VEGF的表迗水