乙型脑炎病毒纳米pcr检测方法的建立及减毒株sa14-14-2序列的分析

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3、炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)引起的一种急性人兽共患传染病。JEV属于黄病毒科(Flaviridae)黄病毒属(Flavivirus)，为单股正链RNA病毒。本研究根据己发表的JEV减毒株SAl4．14—2全基因序列设计合成5对引物，扩增出覆盖JEV仝基因的5个片段，并成功克隆至pEASY-Blunt载体上，经测序拼接获得JEV全基因组序列。结果表明，JEV全基因组长10977bp，除5’端95个核苷酸和3’端385个核苷酸为非编码区以外，其余10296个核苷酸编

4、码一个丌放阅读框(ORF)，依次编码以下蛋白：C、PrM、E三个结构蛋白和NSI、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5七个非结构蛋白。将此全序列与已发表的SAl4源毒株核苷酸及氨基酸序列进行比较分析，其同源性均为99％以上。并发现10701位有碱基G的插入，多数其他已发表的序列均有此情况发生，这可能是传代过程中为适应环境而引起的自然突变。测定SAl4．14．2株全基因序列，不仅为开展基因工程疫苗研究奠定基础，为应用于生产的减毒活疫苗的质控提供了宝贵的材料，也为进一步构建感染性克隆奠定

5、工作基础。纳米PCR技术是一种新型的PCR技术，其原理是把粒径为1nm～100nin的固相纳米金属颗粒悬浮在液体中形成纳米流体。JEV的E基因编码JEV的囊膜糖蛋白(envelopeglycoprotein)，E蛋白是病毒颗粒表面最重要的成分，有多个抗原表位，在病毒入侵宿主中起到重要作用。本研究根据JEVE基因的保守区域设计一对扩增270bp片段的特异性检测引物，将纳米金颗粒添加到PCR反应体系中，同时优化反应条件，首次建立了高效、灵敏的纳米PCR检测方法。采用该方法灵敏度可达1．96x102copi

6、es，普通PCR方法仅为1．96x104copies，且与其他病毒没有交叉感染。由丁纳米材料具有良好的热传导性，因此在添加了纳米金颗粒的PCR循环体系中，PCR反应会更快地达到目标温度，减少了在非目标温度的停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时问，减少非特性扩增，提高特异性扩增产量。通过试验研究表明，该纳米PCR检测方法不仅特异性好，而且其敏感性是普通PCR检测方法的100倍。采用纳米PCR方法和普通PCR方法对临床送检的32份样品进行检测，检测结果纳米PCR检出2份阳性样品，普通PCR检测均

7、为阳性。研究表明，该检测方法不仅为JEV的检测提供一个新的技术，同时对其早期检测和预防奠定基础。关键词：乙型脑炎病毒；全基因组；纳米PCR；E基因万方数据EstablishmentofnanoPCRAssayfordetectionofJapaneseEncephalitisVirusandGenomesAnalysisofVaccineStrsinSAl4-．14．．2Author：RuiYingChaiSupervisor：Prof．JiGuoSunMajor：PreventiveVeterina

8、ryMedicineAbstractJapaneseencephalitis(JE)isaseverezoonoticdiseasecausedbyJapaneseencephalitisvirus(JEV)．Japaneseencephalitisvirus(JEV)istheprototypememberofJEVserogroupwithinthegenusFlavivirus，familyFlavivMdae．Thecompletegenomeo