支原体检测试剂盒（ver.doc

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1、支原体检测试剂盒（ver.1.0）说明书上海华大天源生物科技有限公司2005年9月1．试剂和材料1．1试剂盒组成：1）说明书2）第一阶段PCR引物混合物已分装，可做50次反应3）第二阶段PCR引物混合物已分装，可做50次反应4）阳性对照DNAPCR扩增的支原体DNA片段，无污染性5）10x反应缓冲液适用于多种DNA聚合酶1．2试剂盒中未提供的试剂：1）DNA聚合酶2）矿物油（无热盖式PCR仪需要）3）琼脂糖凝胶4）去离子水1．3需要的仪器：1）PCR仪2）1.5ml微量离心管3）凝胶电泳设备4）离心机5）微量移液器及其适配移液头1．4保存方式：-20oC2．应用

2、及测试原理2．1应用本试剂盒采用聚合酶链式反应技术（PCR）来进行支原体的检测。该方法灵敏度高，可用于检测各种生物材料（如细胞培养物）中所感染的支原体。试剂盒中所含引物能特异性扩增支原体rRNA的保守区域，不会扩增真核细胞或细胞基因组。相比较传统的在选择性培养基中对待检测样品进行长时间培养而言，本方法快速并且不会带来对实验环境的污染问题。样品中是否含有支原体的污染可以通过电泳检查DNA扩增条带来判断，无需荧光或同位素标记过程。本试剂盒能检测的支原体种类包括M.fermentans,M.hyorhinis,M.arginini,M.orale,M.salivari

3、um,M.hominis,M.pulmonis,M.arthritidis,M.neurolyticum,M.hyponeumoniae,M.capricolum等等，上述支原体引起超过95%的生物材料污染问题。注：本试剂盒仅用于研究，不能用于临床诊断及人体样品检测。2．2测试原理支原体的rRNA基因序列是比较保守的，而其基因间区（如16S基因和23S基因之间的区域）的长短却因物种的不同而异。而我们的PCR检测过程分以下两步进行：1）用第一阶段PCR引物对扩增整个基因间区，引物分别结合16S和23S基因编码区域。2）用第二阶段PCR引物进行巢式PCR扩增，两条引

4、物分别结合基因间区保守区以及23S基因编码区（见图1）。通过上述两阶段的PCR扩增，检测的灵敏度以及特异性同时得到了提高，不会受到其他因素（如培养细胞）的干扰。图1.支原体检测原理3．测试方法3．1检测样品的准备当培养物（细胞）汇合率达90%以上时可以取样进行检测。由于细胞碎片的存在有可能影响PCR反应，因此仅细胞培养上清液可用于支原体检测。培养液中的青霉素和链霉素不会影响检测效果。如果培养液时间较长，可能有PCR反应的抑制物累积，影响检测效果。在这种情况下，建议进行测试样品的DNA抽提。细胞培养上清或其他检测样品需要经过5分钟的煮沸过程，然后可以作为PCR检测

5、的模板，具体如下：a.转移100ul培养液上清到无菌的微量离心管中。b.95oC孵育5分钟。c.离心机最高转速甩一下，然后取上清作为PCR反应模板。3．2第一阶段PCRa.按照下列体系配制反应混合液。——————————————————————H2O……………………………………..31.5ul10XPCRbuffer……………………………5uldNTPs(2.5mM)............................................3ul1stPCRmixture.......................................

6、.....2ulMgCl2(25mM)……………………………..6ulTaqDNApolymerase(5u/ul)……………..0.5ul——————————————————————b.加入处理好样品（2ul）到上述反应混合液中。c.如有必要，加入矿物油。d.将所有反应管放入PCR仪，并且以下列参数运行。1cycle94oCfor2min32cycles94oCfor30sec55oCfor1min72oCfor1mincooldownto4oC3．2第二阶段PCRa.按照下列体系配制反应混合液。——————————————————————H2O…………………

7、…………………..31.5ul10XPCRbuffer……………………………5uldNTPs(2.5mM)............................................3ul1stPCRmixture............................................2ulMgCl2(25mM)……………………………..6ulTaqDNApolymerase(5u/ul)……………..0.5ul——————————————————————b.小心加入第一阶段PCR反应产物1ul到反应混合液中。c.如有必要，加入矿物油

8、。d.将所有反应管放入P