设计实验大肠杆菌的检验

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1、南昌大学实验报吿学生姓名：彭学政学号：6002212005专业班级：给排水121实验类型：V验证□综合口设计□创新实验tl期：2014.12.2实验成绩：水处理微生物学实验实验设计：水体中总大肠菌群的检验一、实验目的1、掌握水中细菌总数测定方法；2、常握多管发酵法（MPN）测定水屮大肠菌群的方法；3、了解大肠杆菌数量与水质状态的关系；4、了解大肠杆菌的数量在饮用水中的重要作用；5、掌握污水细菌总数测定方法。二、实验原理大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及

2、血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37°C能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷口氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及冇粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在门然界存在的主耍原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境屮则以大肠菌群英他型别较多。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和

3、复发酵试验三个部分。1.初（步）发酵试验发酵管内装有乳糖蛋口腺液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加冇澳甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原來的紫色变为黄色。浪甲酚紫还有抑制其他细菌如芽胞菌生长的作用。水样接种于发酵管内，37°C下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水屮存在大肠菌群，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果。在量少的情况卜，也可能延迟到48

4、小时后才产气，此时应视为可疑结杲，因此，以上两种结呆均需继续做下而两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48小时后仍不产气的为阴性结果。1.平板分离平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo'smedium）或伊红美蓝琼脂（eosinmethyleneblueaga】，EMBagar）,前者含冇碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为帯金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的牛氏。伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦

5、作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使人肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金屈光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管24小时内产酸产气和48小时产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。2.复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24小吋培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。三、主要仪器设备及耗材显微镜、载玻片、酒精灯、10讪移液管、1ml移液管、锥形瓶、试管刷、电炉、培养皿、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、电热培养箱、灭菌水、烧杯、

6、记号笔、接种环、报纸、银子、吸水纸、天平、PH试纸、钥匙、乳糖蛋引东发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋口月东发酵管（瓶）（内有倒置小套管）、玻璃棒（搅拌用）、试管架、洗耳球、10ml量筒、其它实验辅材；试剂：酒精、革兰氏染色液一套、蒸缰水试验水样：自來水四、实验步骤准备工作：（1）制备培养基1・乳糖蛋白腺培养液：将10g蛋白月东、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于lOOOmL蒸饴水中，调节溶液pH为7.2〜7.4,再加入1.6%漠甲酚紫乙醇溶液ImL,充分混匀，分装于试管中，于121°C高压灭菌器中灭菌15min,贮存于冷暗处备用。2.三倍浓缩乳

7、糖蛋白腺培养液：按上述乳糖蛋口豚培养液的制备方法配制。除蒸憎水外，各组份用量增加至三倍。3•品红亚硫酸钠培养基：①贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20〜30g琼脂加到900mL蒸傭水屮，加热溶解，然后加入3.5g磷酸氢二钾及10g蛋白）j东，混匀，使其溶解，再用蒸徭水补充到lOOOmL,调节溶液pH为7.2〜7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀，定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在121°C灭菌15min,贮存于冷暗处备用。②平皿培养基的制备：将上法制备的贮备培养基加热融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用灭

8、菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙