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《湖州师范学院基因工程复习提纲》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、基因工程复习重点一、载体PTXBIMetAlaSerSerArgVaiAspGlyGlyArgGluPheLeuGluGlySerSerCATATGGCTAGCTCGCGAGTCGACGGCG<3CCGCGAATTCCTCGAGGGCTCTTCCT7promotorT7启动子是最强的启动子，指导传录起始。Lacopterator乳糖操纵基因，可被LacI编码的阻遏蛋口结合抑制转录。SD原核生物翻译起始时核糖体的识别序列位于mRNA上MCS多克隆位点可插入外源基因，不影响其复制。内含多个酶切位点、如图。Intein内含肽CBDchitinbindingdo
2、main（儿丁质结合位点）可与Tag（亲和标记）结合Stopcode终止密码子Amp氨茉抗性基因可用作抗性筛选的重要标记LacI乳糖调控基因编码阻遏蛋白二、质粒提取原理：答：三种溶液：溶液1：50mmol/1葡萄糖维持渗透压，防止DNA受机械损伤降解；25mmol/1Tri-Cl（pH8.0）—维持pH;10mmol/1EDTA（pH8.0）——螯合Ca2+,DNase失活，保护DNA溶液2：0.2mol/NaOH核酸变性（pH>12或pH<3）（解链）1%SDS蛋白变性，裂解细胞。溶液3：7.5mol/LNH4AC(pH7.6)・…-■沉淀蛋白，大分子
3、核酸，调节pH,使小分子核酸复性(可溶)。其它溶液：(1)2MNH4AC沉淀蛋白，溶解核酸；(2)异丙醇沉淀质粒(3)70%乙醇沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。(4)RNase除去细菌RNA过程及作用：(1)1.5ml菌液，12000rpm*1min,弃上清(repeat)收集细菌(2)溶液1(200ul),剧烈混匀提供缓冲液⑶溶液2(400ul),温柔混匀，冰中5min;裂解细胞，蛋白核酸变性(4)溶液3(300ul),温柔混匀，冰中10min;质粒复性(5)13000rpm*5min,取上清；除去细菌蛋白，基因DNA(6)540ul异丙醇，室温10min
4、;沉淀质粒(7)14000rpm*10min,弃上清；除去可溶性杂质(8)100ul2MNH4AC(9)13000rpm*5min,取上清；(10)100ul异丙醇,室温10min;(11)14000rpm*10min,弃上清；(12)70%乙醇500ul,14000rpm*10min,弃上清；除去异丙醇，盐分(13)烘干10-30min,除去乙醇(14)50ulddH2O(含0.1mg/mlRNase),37°C*30min.除去细菌RNA(15)电泳鉴定三、连接反应答：1、总体积为10ul；2、16°C连接过夜；(为什么是16°C?答：连接反应包括两
5、步一是将碱基50%连接(变性)：Tm=2(A+T)+4(G+C),一般在8°C左右。二是将连接末端、DNA连接酶最适温度在37°C左右。综上，要两个同时很好的进行，就将温度调到16°C左右。)3、基因mol/载体mo®10;【平端~15】四、重组克隆的筛选，各方法的优缺点。答：1、抗性筛选;原理：利用载体上具有的抗性基因，进行筛选。优点：可确定有无载体转入。缺点：不能保证外源基因插入，空载体不能被检测出来。2、蓝白斑筛选；原理：LacZ由4个亚基构成；细菌表达一部分（无活性），载体表达一部分（无活性），合在一起构成有活性的LacZ,可分解培养基平板中的底
6、物X-gal,牛成蓝色物质。（需要IPTG诱导表达）一一蓝斑；外源基因插入载体后，使载体部分LacZ失活，无法进行a互补一一白斑。优点：未转入载体的细菌也会形成白斑，需同时用抗性筛选缺点：无法确定基因插入的方向；基因过小，H读框正确，可能无法使载体部分LacZ失活，将产生Q互补，产生蓝斑。3、酶切电泳筛选（*）；原理：选用不同的酶切组合，通过电泳检测DNA片断的大小。优点：可鉴定外源基因的重组和插入方向。缺点：结果可靠但操作比较麻烦；无法检测基因内部的突变。4、PCR筛选；原理：通过特界引物扩增，电泳检测，筛选重组质粒优点：可用2ul菌液做模板，快速，方
7、便，可批量检测重组子。缺点：不能检测基因插入方向；不能检测基因内部突变。5、测序验证；原理：选取阳性克隆，送公司测序；优点：最可靠的检测方法。可确定基因的重组，插入的方向，基因内部的突变等。缺点：价格贵，适于1〜2个克隆的验证。6、表达筛选；SDS-PAGE原理：小量诱导表达；全菌液裂解后进行SDS-PAGE电泳；重组的表达克隆将在特定的位置出现较浓的蛋白条带。（需加不诱导的对照）优点：可检测外源基因的表达。（一般基因的插入，方向，读框都正确）缺点：无法筛选不能有效表达的重组质粒。亲和筛选：原理：50ml菌液诱导表达，超声破菌，用少量亲和beads吸附上
8、清；SDS-PAGE检测，在特点位点将出现一条蛋白带。优点：适用于有亲和Taq的
