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1、实验二、黑曲霉发酵生产纤维素酶大实验一、实验目的1、了解纤维素酶的生产工艺和原理2、掌握液体发酵和固体发酵工艺3、学会DNS法测定还原糖含量的方法和原理二、实验原理纤维素酶可以用于一切含纤维素的生物质的降解，具有广阔的应用前景。高产纤维素酶的微牛物主要有木霉属、曲霉属、根霉属，黑曲霉所产的纤维素酶中B-葡萄糖背酶活力高，能避免酶解产物纤维二糖的阻遏作用，而且安全无毒，故而成为生产纤维素酶的主要菌种Z-o纤维素酶是诱导酶，故发酵生产时需有纤维素物质作诱导剂。以竣甲基纤维素钠作底物，用发酵所得纤维素酶对底物进行酶解，测定酶解液中的还原糖含量（以葡萄糖计），可以计算酶活力高低。还原
2、糖与DNS反应形成棕色物质，颜色深浅与糖含量成正比。三、材料与试剂配制1生产菌种：黑曲霉2、斜面（活化）培养基：酵母膏0.4%,蛋白月东0.6%,可溶性淀粉1%,葡萄糖0.9%,马玲薯浸出液7%,琼脂2%,陈海水（或人工海水）配制，pH7.0-7.4o3、人工海水：NaCl=24g/L;MgSO,-7H20=7.0g/L;NH4NO3=1g/L;KC1=0.7g/L;NaH2PO4=2.0g/L;Na2HP04=3.0g/L,pH7・4。4、微量元素液:FeSO4•7H205.Omg/L,MnSO4•H201.6mg/L,ZnS04•7H201.4mg/L,CoCl22.Om
3、g/L,加蒸憾水200ml使之溶解。5、液体发酵产酶培养基：隸皮作碳源3g,氯化钱或硫酸钱作无机氮源1g,蛋白陈0・05g作有机氮源，人工海水100ml（含1%微量元素液），自然pll值。6、固体发酵产酶培养基：鉄皮：稻草粉二2：1作碳源5g,人工海水12ml（含1%微量元素液，1%氯化鞍或硫酸鞍，0.05%蛋白月东）,自然pH值。7、6%DNS试剂：称取酒石酸钾钠182g溶于500nd水中，加热溶解，于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6g,20.SgNaOH,5g苯酚,5g无水亚硫酸钠,加热搅拌溶解,冷却后定容至1000mlo储存在棕色瓶中放置一周后使用。（提前配制）8
4、、0.1mol/L柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液(pH4.8)0.lmol/L柠檬酸钠溶液lOOmL:称2.941克柠檬酸钠(柠檬酸钠的分子量为294.12),约20L蒸憎水溶解后，转入lOOmL溶量瓶，定容至刻度。0.lmol/L柠檬酸溶液lOOmL:称2.101克柠檬酸(柠檬酸的分子量为210.14),约20L蒸憾水溶解后，转入100mL溶量瓶，定容至刻度。PH4.8的柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液100mL:量取0.lmol/L柠檬酸钠溶液54mL和0.lmol/L柠檬酸溶液46mL混合摇匀。91%CMC-Na溶液称取1.0克竣甲基纤维素纳，用pH4.8的柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液加热溶解
5、。10lmg.mL-1标准葡萄糖溶液lmg/mL葡萄糖溶液250mL:准确称取无水葡萄糖250mg,溶解定容到250ml。11、主要仪器：恒温培养箱，摇床培养箱，可见光分光光度计、冷冻离心机、电子天平等。四、实验步骤1、培养基配制分别按上述方法配制液体发酵培养基和固体发酵培养基，121°C灭菌20分钟。2、抱子悬液的制备：将斜面培养基上的曲霉苞子用少量无菌人工海水洗下，利用玻璃珠在磁力搅拌下搅拌15~20分钟，充分打散孑包子，稀释成5x10,个/讯左右的抱子悬液。2、液体发酵产酶试验按6%(v/v)接种量将浓度约为5X10了个/ml的菌株砲子悬液接入已灭菌的液体发酵培养基(1
6、00ml锥瓶装液30ml),于35°C、180r/min条件下摇床培养6天。发酵液4°C、5000r/min离心15min,上清液稀释10倍，测定发酵液中的酶活力。3、固体发酵产酶试验100ml三角烧瓶装5g已灭菌的固体发酵培养基，按1:3(v/w)接种量将浓度约为5X107个/ml的菌株泡子悬液，于35°C恒温培养箱中培养，接种48小时后隔天翻曲一次，第四或第五天补充无菌水保持基质水分。培养6天后，取发酵成熟曲lg,加蒸徭水10ml,搅拌均匀，30°C,浸提lh,双层纱布过滤，滤液经4°C,5000rmp离心15min,上清为粗酶液。测定时适当分级稀释，使OD54。在0・2
7、~1・0范围。4、酶活力测定及酶活力定义(!)葡萄糖标准曲线绘制准确称取无水葡萄糖250mg,溶解定容到250mlo分别吸取此液1・0,2.0,3.0,4.0,5.0ml至5个25ml的比色管中,用蒸惚水定容到25ml（即加水24,23,22,21,20ml）再分别吸取上溶液各2.5ml于比色管中（糖液分别含糖量为0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mg）,各加2.SmlDNS试剂，煮沸5mino（对照管2.5ml水代替糖液,冷却，测定0D现。表1葡萄糖标准曲线绘制加样表管号123456蒸啊水（mL）
