免疫实验设计117302王清玉97k3b

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1、脂质体佐剂对增强HBsAg免疫原性的作用97k3b王清玉117302脂质体佐剂对增强HBsAg免疫原性的作用97k3b王清玉117302立题依据：中国属于HBV感染的高流行区，普通的乙肝疫苗产生的抗体冇一定的年限,所以需要研制一种疫苗能够延长记忆B细胞存在时间，且注射疫苗后抗体检测阳性率增加，避免注射后抗体不产生的可能性。疫苗免疫激活作用通常较弱，不足以刺激机体产生足够的抗体因此常在疫苗中加入佐剂，可以延缓抗原释放率,延长免疫反应，提高记忆细胞的数量，能够聚集抗原，有效提高免疫球蛋白受体的聚集度。由DC2Chol【1】制备成的正

2、电荷脂质体的表面吸附带负电荷的蛋白质疫苗,增强了疫苗的免疫原性。由于其成分简单、制备方便、结构稳定、安全无毒，不仅适用于蛋口质疫苗，也适用于DNA疫苗，因此通用性强。可望为传统疫苗及治疗性疫苗的研究及应用提供--种新型的免疫佐剂。研究内容：①先丁•抗原或同时与抗原混合注射丁•体内，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的物质，成为佐剂（adjuvant）[2],属非特杲性免疫增强剂。佐剂的种类繁多；例如油性佐剂（费氏住剂），无机化合物（磷酸铝或氢氧化铝）,微生物及其产物（分枝杆菌、短小棒状杆菌或百口咳杆菌以及革兰阴性杆菌的

3、脂多糖），脂质体，免疫刺激复合物等。佐剂增强免疫应答的机制：通过改变抗原的物理形状，延长抗原在机体内保留时间；刺激单核吞噬细胞对抗原的加工处理和提成能力；作为传递工具帮助抗原到达特界的靶免疫细胞器官；刺激淋巴细胞分化，增加扩大免疫应答能力。②1976年10月，世界卫生组织（WHO）专家会议规定了乙肝表面抗原（hepatitisBsurfaceantigen）统一缩写为HBsAg【3】。它的分了量为2.4x10°,系由混合的多肽组成，含冇脂类、糖类和蛋白质等。其对低温冇较强的抵抗力，甲醛可使其灭活，将其加热到60°C10小时可降低

4、其抗原性，100°C5分钟可完全灭活。③脂质体（liposome）是一，种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分了的球形脂质体，直径25〜lOOOnm不等。脂质体可用于转基因，或制备的药物。由丁•生物体质膜的基本结构也是磷脂双分子层膜，脂质体具有与生物体细胞和类似的结构，因此有很好的生物相容性。利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。UK竦亲水脂质休进入人休内部之后会作为一个“入侵者''而启动人体的免疫机制，被网状内皮系统吞噬，从而在肝、脾、肺和骨髓等组织屮靶向性地富集。

5、通过在脂质体膜屮掺入一些靶向物质，可以使脂质体在生物或者物理因素的引导下向特定部位靶向集中。实验目的通过对照实验观察脂质体佐剂对增强IIBsAg免疫原性的作用试剂与器材1、试剂及动物小鼠IL・2检测试剂盒小鼠IFN・y检测试剂盒IL-5检测试剂盒HRP标记的羊抗鼠IgGl及IgG2a试剂乙肝表面抗体检测试剂盒DC-Chol由实验室自行合成，具体合成方法参阅[4]BALB/c小鼠。2、基因重组乙肝表而抗原酵母表达的基因重组HBsAg,含量为60Pg/ml,包括不含佐剂的纯化HBsAg和含铝佐剂的HBsAg。实验步骤1、DC-Cho

6、l正电荷脂质体的制备和形态观察称取DC-Chol20mg放入圆底烧瓶内，加氯仿2ml使其完全溶解，上旋转蒸发仪，室温，30r/min压力0.09Mpa,蒸干后置干燥器抽真空15min后保持过夜。加缓冲液(20mmol/LTris-HCl,150mmol/LNaCl)8ml,4°C通氮气搅拌过夜。以乙酸双氧铀负染法制备样品，用透射电镜观察其形态大小，并计算粒径大小。2、脂质体与HBsAg结合率及稳定性观察将60ug/ml的HBsAg和2.5mg/ml的DC2Chol脂质体制成混合物，其中含HBsAg为4ug/ml,DC-Chol为

7、1.6mg/ml。高速离心后用ELISA法分别测上清和沉淀中的HBsAg量，让算出结合率。3、小鼠的免疫和检测⑴取4〜6周龄BALB/c小鼠36只，雌雄各半，均分为三组，每只鼠均皮下注射不同制剂0.25mlo对照组注射4ug/ml不含佐剂生理盐水稀释的纯化HBsAg。铝剂HBsAg组为用铝稀释剂稀释成4口g/ml。脂质体佐剂组注射HBsAglug,DC-Chol0.25mg混合物。在第1天和第21天分别免疫两次，并于第一次后第21天及第42天、63天三次尾尖采血分离血浆，-20°C保存待测特异性IgG亚型IgGl和IgG2a,用

8、酶标仪读取A450nm/630nm双波长值代表抗体滴度的高低。⑵另取48只鼠分成四组，雌雄各半，对照组为生理盐水，其他各组及免疫方法同上。于初次免疫后7d取鼠脾脏，分离单个核细胞【5】o配成5X106/ml的细胞悬液，加入HBsAg5ug/ml刺激，置24孔板,