基因治疗genetheraphy

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1、第二节基因治疗（Genetheraphy）基因治疗（genetheraphy）：是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病以达到治疗的目的。为达到这一目的，实施相应的策略。11、直接疗法：纠正突变基因也就是在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。这种方法上较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）2、间接疗法：以正常基因替代致病基因。导入外源正常基因，代替有缺陷的基因。对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。二者均是用DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而

2、达到治疗遗传病的目的。2途径就基因转移的受体细胞不同，基因治疗有两种途径：1、生殖细胞基因治疗2、体细胞基因治疗31、生殖细胞基因治疗理论上将正常细胞基因转移到患者的生殖细胞（精细胞，卵细胞早期胚胎）使其发育成正常个体。这是理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中播散。4但还存在某些问题：1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；2）基因转移效率不高，只能用显微注射方法；3）只适用于排卵周期短而次数多的动物，很难适用于人类。（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多者十几个。

3、）52．体细胞基因治疗（somaticcellgenetherapy）是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。6措施：（1）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效表达后，再回输到体内。（2）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体上，准确的替换异常基因，是理想的措施。（3）随机整合，非特定座位，只要有效的表达即可达到治疗的目的。（4）体细胞基因理论不必矫正所有的体细胞。7存在的问题：（1）对特定座位基因转移，目前还存在较大困难；（2）随机插入可能引起后代的基因突变。8基因治疗的方法（Them

4、ethodsofgenetherapy）实施基因治疗的第一个关键性步骤是基因转移一、Gene转移方法91、正常基因的分离与克隆基因治疗首先获得目的基因通常从基因组中分离经克隆↓定位↓表达↓评价表达情况102、外源基因的转移通过不同方法，将目的基因转移至受体细胞。11（1）化学法磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。方法简单，但转化效率低。Ca2(PO4)2+DNA→混合微细颗粒（Ca离子浓度125mmol，DNA离子浓度5～0ug/ml

5、。PH7.0）↓沉淀反应20~30min↓细胞在沉淀物中暴露5~24h12(2)物理方法1、电穿孔法（electroporotion）将细胞至于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。瞬间细胞细胞膜核摸通透性增加高压脉冲DNA渗入细胞132、显微注射法（microinjection）利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核中。14例：转基因动物的制备重组基因DNA微注射（体外）小鼠受精卵回植假妊娠仔鼠动物模型：转基因鼠(每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传)1516clones

6、heepDolly体细胞提取核重组细胞回植Dolly卵细胞去核细胞173、脂质体法（liposome）应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构—脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达。DNA胞融合转化细胞PEG仙苔病毒DNA脂膜184．同源重组法同源重组（homologusrecombination）:外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。是将外源基因定位导入细胞的染色体上。单交换双交换19通过同源重组定点插入珠蛋白基因XhaIBstXIXhaIδβ△βneoXhaIBstXIδΔββneo正

7、常基因座位带有珠蛋白基因的质粒重组质粒C重组后，插入外源基因外源基因片段带有——neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。205.病毒介导基因内转移（Viralmediatedtransfer）是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞。图：感染细胞重组病毒21逆转录病毒(RNA)常用的病毒载体DNA病毒1)逆转录病毒（retrovirus）目前应用最多的最成功的是逆转录病毒，病毒感染细胞后，其基因组RNA经逆转录产

8、生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。完整的病毒颗粒具有插入宿主染色体必需的全套酶系统，适用于介导基