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1、1.请说明基因治疗中的关键技术问题是什么？1.答：基因治疗中的关键技术问题是基因转移。自从80年代中期逆转录病毒载体面世以來，遗传病的基因治疗获得了一次飞跃性进展,至9（）年代初用该载体第一次治疗了腺首酸脱氨^（adeninenucleotidedeaminase,ADA）缺乏引起的严重免疫缺陷综合症患者山。自从那次历史性的治疗示，基因治疗迅速扩展到其他遗传病、癌症、AIDS、心血管疾病等。基因治疗的主耍步骤包括冃的基因的克隆、基因转移、靶细胞的选择和临床试验观察等,其中基因转移是基因治疗的关键步骤。棊因转移方法口J分为直接体内法（
2、invivo）和间接体内法（exvivo）o基因转移技术按载休乂可分为四人类：病毒载体法、非病毒性牛物载体法、非生物性载体法和非载体法。然而，基因转移作为基因治疗的关键技术，在将基因有效地转移到足够多的靶细胞，并使细胞表达这些基因等方面存在不少问题。美国国家人类基因组研究中心主任FrancisCollins认为,Fl前便用的载体及转移技术小还没有一种能用于临床并永久有效的基因转移技术⑵。卜•面介绍儿种基因转移技术：一.直接休内法直接体内法是将基因直接导入体内的各种体细胞中。直接体内法包括以下方法：①非载体法：质粒DNA注射，气雾剂吸
3、入，体内电穿孔；②非生物性载体法：脂质体，微粒子，基因活化基质；③非病毒性生物载体法：配体，基因工程疫苗；④病毒载体法：重组病毒载体局部脏器注射、吸入，病毒活疫苗口服。这些方法操作方便，可反复使用，病人易于接受，但存在外源基因对靶细胞的转染率低，整合较少见，表达往往是暂吋的。此外，各导入方法还存在一些有待解决的问题：1）质粒DNA直接肌肉注射。肌肉注射简单易行，但注入的DNA往往未整合入染色体中,游离于染色体之外，不能复制，表达时间太短。2）气雾剂吸入。质粒DNA或脂质体屮的DNA可通过气雾剂导入呼吸道上皮细胞，带有外源基因的腺病壽
4、载体也可导入呼吸道上皮细胞⑵。3）体内电穿孔术。先皮下注射质粒DNA,然后在表皮和真皮之间加一脉冲电场进行基因转移，这种方法的转移效率较低⑶。4）脂质体体内转染法。脂质体可以包裹DNA,然后它被组织细胞摄入而转染靶细胞⑷。非病毒载体基因转移的第一个临床试验乃是将包裹有DNA的脂质体注入肿瘤中以表达界体组织的移植抗原。但脂质体体内转染较难将DNA导入某些靶细胞，如肝细胞，内皮细胞机械阻挡肝细胞与血流中的脂质体相接触。5）基因枪微粒子轰击法。采用高压电极使包被质粒DNA的金、鸭微粒子高速穿入靶组织或细胞，从而转染靶细胞⑸。6）基因活化基
5、质（geneactivatedmedium,GAM）技术。某些牛.物可降解的基质称作活化基质，如可生物降解的陶瓷、不锈钢或钛等。1996年9刀美国冷泉港实验室兴办的基因治疗会议上，有人报告将浸渍外源基因的活化基质涂于骨折处或伤口，当修补细胞长入GAM时，摄収外源基因，表达可促进愈合的蛋白质⑹。7）配体一受体介导法。将质粒DNA与某种多肽性配体结合，多肽配体再被细胞膜上的受体识别并结合，从而通过吞噬作用将DNA导向特定的靶细胞。若将DNA在体内运送至肝,可以先将DNA和能与肝细胞受体特异性结合的去唾液酸糖蛋口偶联起來以便通过细胞内吞过
6、程而被摄入，这样,DNA大部分被肝细胞所摄取［7】。该法的缺点是内吞水泡易被溶酶体破坏，且其表达只是暂时的。8）重组外源基因的病毒载体的局部或脏器直接注射⑻。该法存在的主要问题是人血清屮的补体成分与病毒载体结合而火活病毒载体。二、间接体内法先从病人身上取得靶细胞，将外源基因在体外转染病人靶细胞后，再将转染的靶细胞输冋病人体内的方法即间接体内法。间接体内法包括以下方法：①非载体法：体外电穿孔，显微注射，共沉淀，同源重组；②非生物性载体法：脂质体，微粒子；③非病毒性牛物载休法：线粒体，哺乳动物人工染色体(mammalianartific
7、ialchromosome,MAC),人类人I.染色体(humanartifi2cialchromosome,HAC),人类天然小染色体(humanmicrochromosome,HMC);④病毒载体法：逆转录病毒(retrovirus,RV)、腺病^{(adenovirus,AV)、单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus,HSV)、EB病毒(EBV)、人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)、痘病毒、昆虫病克等。其中，非载体间接体内法的各种方法介绍如下：1)体外电穿孔法。利用脉冲
8、电场在细胞膜上瞬间形成微小孔而将DNA导入细胞。电穿孔法导入的DNA拷贝数很侑限，大多数为单拷贝，通过双选择剂选择，可提高转染细胞的拷贝数。此外，电穿孔法的细胞死亡率亦较高⑼。2)显微注射法。显微注射法将DNA直接注入细胞核，避免了胞
