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《全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性作者：丰炳峰，董晨，关凤军【摘要】目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的方法，研究MSC的生物学特性。方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSC，体外培养和连续传代,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化；利用四唑盐比色（MTT）法测定MSC的生长曲线；流式细胞仪（FCM）鉴定MSC膜抗原。结果原代分离的MSC在接种后48h贴壁,细胞形态为椭圆形、多角形及短梭形,12天时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化。细胞传代后2天内处于潜伏期,3天后进入生长期,7天后进入
2、平台期。FCM检测CD45、CD90阳性率分别为19.60%、95.38%。结论贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSC,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSC的一般生物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。【关键词】间充质干细胞;骨髓;贴壁法分离培养 Abstract:ObjectiveToestablishasimpleandeffectivemethodofisolation,purificationandcultivationofratbonemarroesenchymalstemcells(MSC)invitro,an
3、dexplorethEirbiologicalcharacteristics.MethodsMSCentculturemethod.ThemorphologicalchangesoftheMSCicroscope.ThecellgroeasuredbyMTTmethod,andmembraneantigensetry(FCM).ResultsTheMSCinprimarycultureenttooktheoval,asteroid,shortandfusiformshapes.12daysaftercultureinDMEM-F12mediumcontain
4、ing10%FBS,thecellsreached90%confluenceinsinglelayers,takingalongandfusiformshape.FurtherpurificationentculturemethodcanbeeffectivelyusedtoisolateandpurifyratMSC.TheculturedMSCarestableingroakethemidealseedcellsfortissueengineering. Keyesenchymalstemcells;bonemarroentculture 骨髓间充质
5、干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)是骨髓内除造血干细胞外另一种具有多向分化潜能的成体干细胞，在特定的条件下能分化为多种组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、肌腱、脂肪细胞、成纤维细胞及神经星状细胞等，且具有极强的自我修复能力。加之其具有获取简便、对供体损伤小、增殖力强、来源广泛、免疫原性弱［1］、自体移植不发生排斥反应［2］、不涉及伦理等特点，成为研究的热点。本实验通过分离培养、鉴定大鼠MSC，研究其生物学特性，从而为MSC的体外定向分化及作为种子细胞进一步应用于组织工程和再生医学提供实验基础。 1材料和方法 1.1材料DMEM-F12
6、培养基(Gibco公司),优级胎牛血清(杭州四季青有限公司)，蛋白酶(Sigma公司),倒置显微镜(Nikon公司)，细胞培养箱(Sanyo公司)。实验动物为雄性SD大鼠,3周龄,100～150g,清洁级(徐州医学院实验动物中心提供)。FITC标记CD45、CD90抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。 1.2方法 1.2.1MSC的分离纯化及培养将大鼠脱臼处死后用碘伏浸泡5min,无菌条件下分离出大鼠股骨和胫骨,离体的骨骼放入灭菌PBS缓冲液中冲洗。剪去干骺端,暴露骨髓腔,无菌注射器抽取未添加肝素的含10%FBS、100mg/L青霉素、100mg/L链
7、霉素的DMEM-F12培养基反复冲洗骨髓腔,直至腔内所有骨髓血冲净。接种于含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基,置于37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱内培养。3天首次换液,以后每3天换液1次,7～14天细胞生长融合达80%以上,以0.25%胰蛋白酶消化后按1∶3的比例传代培养。倒置显微镜下逐日观察细胞形态。 1.2.2MSC生长曲线的测定原代培养细胞达80%以上融合后,D-Hank液冲洗,胰酶消化传代,并标记为P1。取生长状态良好的第3代细胞,胰酶消化后,按1×107/L接种于96孔培养板中,每孔培养液为100μl。每24h取上述各代细胞
8、各3孔,MTT比色法测各孔光密度值(D490值),连
