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1、全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性【摘要】 目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的方法，研究MSC的生物学特性。方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSC，体外培养和连续传代,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化；利用四唑盐比色（MTT）法测定MSC的生长曲线；流式细胞仪（FCM）鉴定MSC膜抗原。结果原代分离的MSC在接种后48h贴壁,细胞形态为椭圆形、多角形及短梭形,12天时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化。细胞传代后2天内处于
2、潜伏期,3天后进入生长期,7天后进入平台期。论文百事通FCM检测CD45、CD90阳性率分别为19.60%、95.38%。结论贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSC,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSC的一般生物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。【关键词】 间充质干细胞;骨髓;贴壁法分离培养 Abstract:Objective Toestablishasimpleandeffectivemethodofisolation,purificationandc
3、ultivationofratbonemarrow-derivedmesenchymalstemcells(MSC)invitro,andexploretheirbiologicalcharacteristics.Methods MSCwereisolatedandpurifiedforcultureinvitroandserialpassagebytheattachmentculturemethod.ThemorphologicalchangesoftheMSCwerecontinuouslyob
4、servedundertheinvertedmicroscope.ThecellgrowthcurvewasmeasuredbyMTTmethod,andmembraneantigensweredetectedwithflowcytometry(FCM).Results TheMSCinprimaryculturewhichwereadheredtoplasticsurfacewithin48hafterdisplacementtooktheoval,asteroid,shortandfusifor
5、mshapes.12daysaftercultureinDMEM-F12mediumcontaining10%FBS,thecellsreached90%confluenceinsinglelayers,takingalongandfusiformshape.Furtherpurificationwasachievedbyexpansionatserialpassages.MSCwereinlatencyfor2days,convertedintogrowthperiodonthe3rddayand
6、enteredthestationaryphaseonthe7thday.FCMresultsindicatedthatthepositiverateofCD45andCD90was19.60%and95.38%,respectively.Conclusion TheattachmentculturemethodcanbeeffectivelyusedtoisolateandpurifyratMSC.TheculturedMSCarestableingrowthwithactiveprolifera
7、tionandsharethegeneralbiologicalcharacteristicsofMSC,whichwillfurthermakethemidealseedcellsfortissueengineering. Keywords:mesenchymalstemcells;bonemarrow;attachmentculture 骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)是骨髓内除造血干细胞外另一种具有多向分化潜能的成体干细胞，在特定的条件下能分化为多
8、种组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、肌腱、脂肪细胞、成纤维细胞及神经星状细胞等，且具有极强的自我修复能力。加之其具有获取简便、对供体损伤小、增殖力强、来源广泛、免疫原性弱［1］、自体移植不发生排斥反应［2］、不涉及伦理等特点，成为研究的热点。本实验通过分离培养、鉴定大鼠MSC，研究其生物学特性，从而为MSC的体外定向分化及作为种子细胞进一步应用于组织工程和再生医学提供实验基础。 1 材料和方法 1.1 材料 DMEM-F12培养基(Gibco公司),优级胎牛血清(杭
