bt基因对转基因水稻生物学性状影响研究的试验方案付健美

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1、Bt基因对转基因水稻生物学性状影响研究的试验方案试验目的与任务外源棊因在水稻棊因组内的插入是随机的。外源棊因的随机插入就可能会破坏水稻本身的基因结构，从而可能导致水稻表现型的改变。迄今，也很少有研究发现转基因水稻对某些主要病原菌抗性比亲本水稻还要低这一现象。本实验以转crylAb基因Bt明恢水稻及其对照亲木为材料主要从以下3个方面进行研究这个现象：（1）Bt棊因对水稻农艺性状的影响（2）Bt基因对水稻内生菌多样性及功能的影响（3）转Bt基因水稻与亲本水稻对水稻主要病原菌抗性差异研究第一章Bt基因对水稻农艺性状的影响1材料将Bt明恢63、明恢63种

2、子浸种发芽后分别植株于一次性透明塑料杯中，放到7楼温室培养。2方法2.1转Bt基因水稻农艺性状的考察2.1.1测定转基因水稻（BT明恢63）和亲本水稻（明恢63）在不同生长发育期的株高、叶长、叶宽、叶面积和叶绿素含量在苗期、分蘖期、拔节期、成熟期分别取5株，用以下方法测这5个指标（1）株高…120cm规格的直尺测量，每株量3测，记录结果！（2）剑叶长、剑叶宽…叶面积仪（3）剑叶面积…长喷*0.75（4）剑叶叶绿素含量一叶绿素仪2.2.2观察转基因水稻（BT明恢63）和亲本水稻（明恢63）在不同生长时期的剑叶内部结构剑叶内部结构的观察：首先在苗期、

3、拔节期、分蘖期和成熟期各随机取5片剑叶鲜样（可以在2.5%戊二醛，4度冰箱保存一星期）；制备石蜡切片。其次，使用本实验室的徕卡CM-1100冷冻切片机做水稻叶片的切片。再次，将切好的切片用本实验室的日立台式扫描电子显微镜TM-1000观察样品的精细结构。最后，挑选某一个或几个时期Bt明恢与亲本明恢剑叶的内部结构差异明显的样本，送到南农生物学实验中心进行透射电镜的观察。2.2.3测定转基因水稻（BT明恢63）和亲本水稻（明恢63）生物量的测定分别随机选3株，先在105度杀青1920mim,以终止样品中酶的活性，再降低烘箱温度到80度，直到样品烘干至

4、恒重为止，一般24h。放在天平上称其重量并记录。2.2.5测定转基因水稻（BT明恢63）和亲本水稻（明恢63）的根系形态在苗期、拔节期、分蘖期和成熟期各随机取5个根系，用根系扫描仪测定根总长、根平均直径、根总面积、根总体积、根尖计数、分差计数和交集计数等，2.2.4室内考种测定收获期BT明恢63和明恢63的穗粒数、有效分蘖数、单株产量、千粒重在收获期各随机取10株，对有效分蘖数、穗粒数、单株产量、千粒重等进行室内考种。2.2转基因水稻（BT明恢63）和亲本水稻（明恢63）水稻根、茎和叶的生理生化指标2.2.1可溶性糖GB2.2.2可溶性蛋白质的测

5、定GB2.2.3游离氨基酸的测定一~GB2.2.4Bt蛋白含量的测定ELISA2.2.5维生素GB维生素又称抗坏血酸（AsA）,是广泛存在于新鲜水果蔬菜及许多生物中的一种重要的高活性物质。作为抗氧化剂，它参与许多新陈代谢过程。近几年来在植物衰老和逆境等自由基伤害理论的研究中，维生素C作为生物体内对自由基伤害产生相应保护的系统成员之一，更引起了人们的研究兴趣。同时它在光合作用、光保护、细胞生长和分裂、一些重要的次生代谢物质和乙烯的合成中也具有非常重要的生理功能。2011年发表过这样一篇文献是水稻维生素C合成相关基因的表达分析，该文献利用实时定量PC

6、R对与维生素C合成与代谢相关的基因在水稻不同组织中的表达进行分析。2012年同样也有一项研究已经致力于水稻维生素C合成相关基因表达分析的研究及转基因水稻中过量表达维生素C代谢相关基因的研究，同时该项研究也利用HPLC测定水稻叶片中的维生素C含量。鉴于以上的理由，毕竟Bt基因的插入很随机，它是否会影响与维生素C合成与代谢相关的一些基因的表达沉默与启动，以至于影响水稻不同组织中维生素C的含量。Bt基因的插入可能会增加维生素C含量使水稻抗逆境能力增强、光合作用能力增强、稻米成熟时间缩短。2.3转基因水稻(BT明恢63)和亲本水稻(明恢63)叶片的转录组

7、和蛋白组的测定和分析2.3.1转Bt水稻叶片及亲本水稻叶片转录组的测定和分析步骤一mRNA进行基因表达的差异分析A总RNA的提取B用带有oligo(dT)磁珠富集真和生物mRNAC加入fragmentationbuffer将mRNA打断成段片段D以mRNA为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成第一条cDNA链E然后加入缓冲液、dNTP、RNaseH、DNA聚合酶I合成第二条cDNA链。G经过QiaQuickPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱后做末端修复并连接测序接头。H用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择。I进行PCR扩增一产物

8、与载体连接一转化大肠杆菌H使用建好的文库进行测序Jmapping2.3.2转Bt水稻叶片及亲本水稻叶片差异表达蛋白组的测定和分析双向电泳