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1、TGF-g2刺激人Tenon囊成纤维细胞增殖，表达CTGF和合成Fn姓名：2014年6月25日TGF-P2刺激人Tenon囊成纤维细胞增殖，表达CTGF和合成Fn【摘要】目的：研究转化生长因子(TGF-P2)和结缔组织生长因子(CTGF)在滤过泡瘢痕化中的作用。方法：用不同浓度的TGF-P2刺激HTF,然后用RT-PCR和免疫细胞化学法分别检测CTGF和Fn的表达，用MTT法检测细胞的增殖。结果：TGF-p22pg/L到5gg/L范ffl有剂量依赖性地促进HTF的细胞增殖，CTGF的表达和Fn的合成的趋势(P
2、0.01)，但0.5(ig/L,l^ig/L与正常对照组对细胞的增殖作用差别无显著性,5Mg/L与10
3、ig/L增强细胞的增殖作用也无显著性差异(P0.05)。结论：TGF-P2能够明显地促进HTF细胞増殖，并增强其卜游介质(CTGF)的表达和合成细胞外基质-纤维连接蛋白(fibronetin，Fn)。【关键词】结缔组织生长因子转化生长因子-P2纤维连接蛋DTenon囊成纤维细胞青光眼滤过术0引言宵光眼滤过术后滤过泡的瘢痕化是手术失败的关键原因，滤过泡瘢痕形成机制涉及很多生长因子，冇研究表明与滤过手术联系最密
4、切的则为转化生长因子TGF-p2[l]o结缔组织生长因子(CTGF)是继TGF-p之后发现的又一个重要的促纤维化因+,被认为是TGF-P的下游作用元件以及纤维化进程的启动因子[2]，其作用主要表现为促进细胞有丝分裂和增生、趋化细胞、诱导细胞粘附、促进细胞外基质(ECM)的合成[3],针对CTGF的治疗有可能开辟一条仅特异作用于TGF-p引起的纤维化而不影响其他免疫活性作用发挥的新途径。有研究证实，TGF-p2能够刺激HTF产生CTGF[4],但TGF-p2是否也其宥相同的作用，这点在人体滤过泡的瘢痕化中仍未得
5、到证实，W此，我们设计不同浓度的TGF-P2刺激的HTF细胞，看其是否能促进细胞的增殖，表达CTGF以及合成Fn,初步探讨CTGF在滤过泡瘢痕化中可能的作用。1材料和方法1.1材料人重组TGF-P2蛋白（Peprotech,USA）,鼠抗人Fn抗体（Santacruz,USA）,SP试剂盒（北京中杉），DAB试剂盒（武汉傅士德），羊抗人多克隆CTGF抗体（RD，USA）,羊抗兔二抗（武汉博士徳），二中基四氮唑盐（MTT）（Sigma,USA）,二甲基亚枫（DMSO）（Sigma，USA）,TrizolReag
6、ent（Invitrogen,USA）,逆转录及PCR试剂盒（Progrema，USA）。以青光眼滤过术中取下的人Tenon囊筋膜组织，釆用组织块贴壁培奍法［5］培养人Tenon囊成纤维细胞。取3〜6代对数生氏期HTF进行实验。1.2方法消化80%融合的细胞后，用含150g/L新生牛血清的DMEM培养液调成5X107/L细胞悬液，按100pL/孔接种于96孔板，24h后吸除培养液，分为空白对照组（无血清DMEM培养液）和6个处理组：分别为不同浓度的TGF-P2（0.5,1，2,4,5,10pig/L）,诱导培
7、养24h，每组设8个复孔。24h后加入MTT20（iL/孔，继续在CO2培养箱屮培养4h后，弃去培养液，加入DMSO150）iL/孔，静置30min,在酶联免疫测定仪上测其在570/630nm处的吸光度值（A）。实验重复3次。另将细胞悬液1X108/L密度接种于放有盖玻片的6孔板中，贴壁24h后选用3个TGF-P2浓度组（T12gg/L,T24gg/L,T35pg/L）及正常对照组（N组）（每组4片）分别加入各自不同的培养液共3mL,诱导24h后终止培养，用4°CPBS漂洗3次，再放入4°C固定液（冷丙酮：无
8、水乙醇=1:1的混合液）中固定15min,晾干后再按S-P法即用型试剂盒和DAB试剂盒说明书操作，鼠抗人Fn多克隆抗体稀释度1:100,DAB显色2min,苏木素复染。PBS代替一抗作阴性对照。将每张片图像摄入计算机，通过HMIAS-2000高清晰度彩色医学图像分析系统，得山代表每张爬片阳性表达强弱的平均灰密度值（A）,然后再进行统计学处理。实验重复3次。另收集各组（实验分组同上：Tl,T2,T3,N共4组）培养瓶中的HTF,用TrizolReagent裂解细胞，提取总RNA,于波长260,280nm处测定吸
9、光度（A）值。逆转录反应条件为42°Clh,99°C5min,5°C5min,同吋设无RNA的阴性对照。PCR反应引物设计应用PrimerPremier5.0软件，其内参照为P-actin。预期CTGF的扩增片断K度为292bp,上游引物为5'-TCTTCGGTGGTACGGTGTA-3'，下游引物为5'-ACCAGGCAGTTGGCTCTAA-3';p-actin扩增片段长度为283bp，上游引物
