实验四氨基酸纸层析折光率的测定

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1、实验四　氨基酸纸层析、折光率的测定一、实验目的１、本实验采用纸色谱对几种氨基酸进行分离和鉴定,以了解纸色谱的原理，练习其操作方法。2、了解测定折光率的简单原理，掌握阿贝折射仪的使用方法。二、实验原理1、色谱分析法（简称色谱法或层析法）色谱分析法简称色谱法或层析法。1906年，俄国植物学家Tsweet将CaCO3放在竖立的玻璃柱中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚冲洗。在柱的不同部位形成色带，因而命名为色谱。管内填充物称为固定相，冲洗剂称为流动相。色谱法就是利用混合物中各组分在固定相和移动相中进行反复的吸附或分配作用，达到各组分分开的目的。分类:(

2、1)按照被分离物质在固定相中的作用原理不同，色谱法可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱等。(2)按照操作方式不同，又可分为柱色谱、薄层色谱、纸色谱、气相色谱、和高效液相色谱等。纸色谱为分配色谱，色谱过程在固定相构成的平面状层下进行。滤纸为载体，固定相为滤纸上的水，流动相（展开剂）为用水饱和过的有机溶剂。纸色谱属于分配色谱。衡量物质向上移动的物理量是比移值（Rf）例:大黄中游离蒽醌的纸色谱图溶剂前沿大黄素甲醚芦荟大黄素大黄素大黄酸点样点２、化合物的折光率折光率象沸点一样，是液体有机物最重要的物理常数之一。衡量液体有机物纯度的标准，折光率比沸点更可靠。利用折光

3、率不仅可鉴定未知物，且可确定沸点和结构相似的液体混合物的组成。液体的折光率不但与结构和入射光的波长有关，而且也受温度、压力等因素的影响。由于大气的变化对折光率的测定影响并不显著，所以，通常表示折光率时只标明入射光线的波长和测定时的温度。例如，在入射光为钠的黄光(波长为589.3nm)，测定温度为20℃时，水的折光率为1.3330，表示为=1．3330。这里n代表折光率，20代表测定时的温度，D代表钠光。折光率可以通过折光仪精确地测定出来，常用的是阿贝(Abble)折射仪。阿贝折射仪基本原理在一定的外界(如温度、压力等)条件下，波长一定的单色光从介质A斜射入介

4、质B时，要发生折射现象。其入射角α与折射β的正弦之比是一个常数，并且与这两个介质的折射率nA(介质A)、nB(介质B)成反比。即：根据折射定律可得：当则所以(折射角的最大值，称为临界角)时sin0=1在临界角以内的区域都有光线通过,是明亮的，在临界角以外的区域没有光线通过，是暗的。在临界角上正好是“半明半暗”（如图4-2所示）。目镜上有一个十字交叉线，若十字交叉线与明暗分界线重合，就表示光线由被测液体进入棱镜时的入射角正好为90。由于,棱镜的折光率nB是常数，各种液体的折光率不同，临界角也不同。通过测定临界角的相对位置，经过换算就可以找出液体的折光率，阿

5、贝折光仪的刻度是经过换算后的折光率的读数，故可直接读出折光率。阿贝(Abbe)折光仪阿贝(Abbe)折光仪阿贝（Abbe）折光仪的结构如图。它的主要组成部分是两块直角棱镜组成的棱镜组，上面一块是表面光滑的测量棱镜，下面一块是表面磨砂的可以开启的辅助棱镜。左面的镜筒是读数镜筒，内有刻度盘，其上面有两行数值。右边一行是折射率数值（1.3000～1.7000），左边一行是工业上测量溶液浓度的标度（0～95%）。右面的镜筒是测量目镜，用来观察折光情况。筒内装有消色散棱镜。光线由反射镜射入辅助棱镜，发生漫射，以不同人射角射入液层，然后再射到测量棱镜的表面上。此时一部分

6、光线经折射后进入测量目镜，另一部分光线则发生全反射。调节螺旋，以使测量目镜中的视野半明半暗。三、实验步骤（一）纸层析1．在滤纸条上端边缘约1厘米的中央剪一小孔。2．将滤纸条平放于洁净的纸上，在距离滤纸下端1cm处用铅笔轻画一横线，并在横线的中央画一直径为2mm的小圆圈。3．用毛细管吸取氨基酸混合液，在滤纸条下端的小圆圈内点样。4.取干燥大试管，加入被水饱和的酚溶液10ml，注意勿使溶液沾到试管壁上，将试管垂直固定于铁架台上。5.在距滤纸条下端0.5cm处穿大头针。从滤纸条上端小孔处穿棉线并左右分开，调节线的高度使滤纸垂直悬于试管内且下湍浸入溶液0.5cm，注

7、意勿使点样点浸入溶液中，亦勿使滤纸条接触试管壁。6.此时即可看到溶剂向上移动，溶剂升到一定高度时，小心将纸条取出，以铅笔标出溶剂上升的前沿。7.将滤纸条两端，用大头针钉在小木框上，吹干后用喷雾器均匀地喷一层0.2%茚三酮乙醇溶液，然后再将滤纸条吹干，即可看到纸上显出三色点，每个色点代表一种氨基酸。8.分别测量并计算三种氨基酸的Rf，再根据教师供给的值确定此三个色点各为何种氨基酸。9.留在试管内的酚溶剂切勿弃去，塞紧塞子。氨基酸Rf值蛋氨酸0.84丙氨酸0.62谷氨酸0.32（二）折光率的测定1、折光仪读数的校正（1）将阿贝折光仪置于普通白炽灯前或靠近窗户的桌

8、子上。但不要放在直射的阳光下，以免液体试样迅速蒸发。