实验四-氨基酸的纸层析法.doc

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1、姓名：郭沈杰年级专业：2012级生物科学同组者：蔡萍萍学号：实验四氨基酸的纸层析法一、实验目的了解并掌握氨基酸纸层析法的原理和方法。二、实验原理以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为固定相，它与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出

2、来，形成距原点不等的层析点。在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。本实验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、苯丙氨酸。三、实验仪器1、 

3、新华滤纸2、 层析缸3、 细线4、 点样管5、 橡皮筋6、 电吹风7、 喷雾器8、铅笔9、直尺四、实验试剂1、精氨酸、苯丙氨酸、混合氨基酸（精氨酸、苯丙氨酸）2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v）3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中五、实验步骤1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，在上面相同间隔画3圆点（原圈直径约5mm）。2、取毛细管3支，分别吸取精氨酸、苯丙氨酸、氨基酸混合液少许，在原圈处点样，

4、样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60℃）烘干。5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基酸种类。（书上图谱横着看）六、实验结果实验数据组数谷氨酸苯丙氨酸混合氨基酸原点到溶剂前沿的距离（cm）7

5、.907.907.90原点到层析点中心的距离（cm）1.354.554.551.35Rf0.17090.57590.57590.1709与表中标准氨基酸Rf值比较，可知混合氨基酸是1：1混合的谷氨酸和苯丙氨酸的混合物。原始数据七、实验分析1、纸层析法是利用各种氨基酸在两相中不断进行分配，分离系数不同，导致氨基酸随流动相的速率不同，在滤纸上相互分离形成距原点不等的层析点，而且在一定条件下，不同的氨基酸有固定的移动速率的原理。由于分离时间，室温等条件的限制，分离会出现误差，可以通过计算相对的Rf值,减少实验误差。2、根据各个氨基酸的Rf值，知道要分离的

6、氨基酸是否能被分开，分的有多开。就是说如果知道每个氨基酸的Rf值，没做实验，基本上就知道各个氨基酸在纸层析后的相对位置，及氨基酸谱带。3、纸上分配层析所出现的拖尾现象原因是在点样品后，样品点吹的太干燥所致。八、问题讨论1.Rf的影响因素：室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等2.注意事项：1）样点直径不宜超过5mm，且应边吹边点。2）点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层。3）喷茚三酮—无水丙酮液时要均匀，注意使溶液不倒流，不间断。4）观察层析点时要多等一段时间，使得显色点更清楚，更有利于几何中心的确

7、定。5）操作时要带手套,一定不要直接用手接触滤纸已层析过的部分。因为手上的油脂汗液等会影响展层剂，影响氨基酸的溶解度