四节细菌和链霉菌的分子克隆载体

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1、第四节细菌和链霉菌的分子克隆载体一、革兰氏阴性菌克隆载体1.移动载体（mobilizablevector）1)特点i.广谱宿主范围，即复制子和遗传标记具很宽适应范围ii.DNA的转移常常需要经过中间宿主细胞和借助于辅助质粒，DNA进入中间宿主细胞可用直接转化2)结构i.RK2质粒的结构a.oriVDNA复制起点b.DNA复制基因c.DNA转移基因d.oriTDNA转移基因e.药物抗性基因（AprKanrTcr）G+菌的质粒和载体ⅱ.移动载体与辅助质粒pRK2013:将RK2中的全部转移基因和Kan

2、r基因插入到E.coli的colE1质粒中构成辅助质粒pRK290:余下部分（Apr除外）构成移动载体（约20Kb）*当选用E.coli为中间宿主时，必须先将pRK290经过直接转化引入E.coli（pRK2013也应转入同一细胞）。当要转移pRK290时，只需将E.coli细胞与其他G‐细胞混合，在pRK2013的作用下，pRK290可接合转移至终宿主细胞。3)不相容群（incompatibilitiygroup）克隆载体ⅰ.P群：RP4RK2RP1R682-5拷贝ⅱ.Q群：R300BRSF10

3、10R116215-20拷贝ⅲ.W群：Sa2-5拷贝4）遗传标记基因大多数为抗生素标记基因，要注意不同G‐菌中的表达活性G-细菌中重组质粒的转移2.非移动载体(non-mobilizablevector)1)特点：不能接合转移，但可经过直接转化进入那些可形成感受态的细菌，具有广谱和窄谱两大类载体2)实例：P4D0105-由E.coli噬菌体P4构建而成，适合于E.coli和肺炎克蕾伯氏菌。ⅰ.当辅助噬菌体提供P4整合酶时，该载体可整合到E.coli染色体中，整合入肺炎克蕾伯氏菌染色体则与整合酶无关

4、。ⅱ.该载体含有一个virl突变和在引物酶基因α中存在一个琥珀突变(am52)，在无抑制子突变的菌株中，该载体不能自主复制，但在有抑制子突变的菌株中(琥珀抑制子突变体），该载体则可自主复制。P4D0105载体的结构二、革兰氏阳性菌（G+）克隆载体1.枯草杆菌克隆载体1）B.subtilis作为宿主菌的优点ⅰ.芽孢形成过程可用于阐明细胞发育过程ⅱ.遗传背景较清楚，可直接导入外源DNAⅲ.非致病细菌，因而安全ⅳ.研究结果可用于其它芽孢杆菌ⅴ.存在各种分泌蛋白质2）B.subtilis作为宿主菌的缺点ⅰ

5、.存在多种蛋白酶基因和相应产物ⅱ.外源DNA导入细胞后不稳定，易发生重组反应3)克隆载体ⅰ.复制子来源i)质粒DNA质粒名称大小(kb)标记基因拷贝数来源pUB4.5Kanr50金黄色葡萄球菌pE1943.7Eryr10同上pC1942.9Cmlr同上pSA05014.1Strr20-50同上pBC61蜡状芽孢杆菌pLS103B.subtilispFTB14淀粉液状芽孢杆菌pAB124Tcr嗜热脂肪芽孢杆菌pTB1925.8KanrTcr同上pT1814.4Tcr蜡状芽孢杆菌pCW7同上pAMα1

6、S.faecalisii)噬菌体Ф10539.2kbB.subtilis温和噬菌体Q1190kb同上当外源DNA插入上述载体时，Ф105生长的功能丧失,当重组DNA分子转入已含有Ф105的溶源化菌株时，重组DNA分子可以十分有效地插入染色体DNA中。这种技术称之为"原噬菌体转移技术"ii.标记基因ⅰ)抗生素抗性基因ⅱ)thy基因(三甲氧苄二氨嘧啶)：该基因表达可导致枯草杆菌死亡，但当外源DNA插入该基因后，宿主细胞便能存活iii.表达载体的启动子常用的有液化芽孢杆菌的α-淀粉酶基因启动子和sp2启

7、动子2.其它G+克隆载体1)枯草杆菌的克隆载体常可用于其它芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌2)嗜热芽孢杆菌、肺炎双球菌常采用自身的天然质粒所组建的克隆载体三、链霉菌克隆载体1.质粒载体质粒名称大小(kb)来源　　　　宿主范围拷贝数SLP1.214.5天兰色链霉菌窄谱,变青链霉菌　4-5SCP2(性因子)″″″1-3pIJ101　　8.9变青链霉菌广谱(各种载体构建)40-300pFJ10320S.granulorubor生二素,金霉素,弗氏链霉菌pUC69.2S.cepinosue广谱30-402.噬菌体

8、载体ΦC31-天兰色链霉菌的温和噬菌体，长41kb，其中32kb是必须的,具粘性末端的线状DNA分子，可插入约10kb外源DNA，可裂解和溶源化生长。3.标记基因杂合致死（lethalzygosis,Ltz)：凡是含有接合质粒的链霉菌可在一受体链霉菌菌丝体上形成麻点，这种转移可导致受体菌生长受到抑制，常用的受体菌是变青链霉菌，这种表型也可用于转化体的选择。第四节真菌分子克隆载体一、酿酒酵母(Saccharomyceacerevisiae)的分子克隆载体1.克隆载体的种类1)按复制方