生物化学实验指南 (1)

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1、实验一糖的呈色反应和定性鉴定目的要求(1)学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法。(2)了解鉴定还原糖的方法及其原理。Ⅰ.Molish反应——α-萘酚反应实验原理糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与α-萘酚作用形成紫红色复合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈颜色近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。试剂Molish试剂

2、：取5gα-萘酚用95%乙醇溶解至100mL，临用前配制，棕色瓶保存。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。操作方法取试管，编号，分别加入各待测糖溶液1mL，然后加两滴Molish试剂，摇匀。倾斜试管，沿管壁小心加入约1mL浓硫酸，切勿摇动，小心竖直后仔细观察两层液面交界处的颜色变化。用水代替糖溶液，重复一遍，观察结果。Ⅱ.蒽酮反应实验原理糖经浓酸作用后生成的糠醛及其衍生物与蒽酮（10-酮-9，10-二氢蒽）作用生成蓝绿色复合物。试剂蒽酮试剂：取0.2g蒽酮溶于100mL浓硫酸中，当日配制。待测糖溶液，同Molish试验。操作方法取

3、试管，编号，均加入1mL蒽酮溶液，再向各管滴加2~3滴待测糖溶液，充分混匀，观察各管颜色变化并记录。Ⅲ.酮糖的Seliwanoff反应实验原理该反应是鉴定酮糖的特殊反应。酮糖在酸的作用下较醛糖更易生成羟甲基糠醛。后者与间苯二酚作用生成鲜红色复合物，反应仅需20-30秒。醛糖在浓度较高时或长时间煮沸，才产生微弱的阳性反应。试剂Sediwanoff试剂：0.5g间苯二酚溶于1升盐酸（H2O∶HCl=2∶1）(V/V)中，临用前配制。1%葡萄糖；1%蔗糖；1%果糖。操作方法取试管，编号，各加入Sediwanoff试剂1mL，再依次分别加入待测糖

4、溶液各4滴，混匀，同时放入沸水浴中，比较各管颜色的变化过程。Ⅳ.Fehling试验实验原理费林试剂是含有硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在，则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。为防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehlin试剂中加入酒石酸钾钠，它与Cu2＋形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。费林试剂是一种弱的氧化剂，它不与酮和芳香醛发生反应。试剂试剂甲：称取34.5g硫酸铜溶于500mL蒸馏水中。试剂

5、乙：称取125gNaOH137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。临用前，将试剂甲和试剂乙等量混合。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。操作方法取试管，编号，各加入Fehling试剂甲和乙1mL。摇匀后，分别加入4滴待测糖溶液，置沸水浴中加热2~3min，取出冷却，观察沉淀和颜色变化。Ⅴ.Benedict试验实验原理Benedict试剂是Fehling试剂的改良。Benedict试剂利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，其碱性较Fehling试剂弱，灵敏度高，干扰因素少。试剂Benedict试剂：将170g柠檬酸

6、钠和100g无水碳酸钠溶于800mL水中；另将17g硫酸铜溶于100mL热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅，最后定容至1000mL。该试剂可长期使用。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。操作方法取试管，编号，分别加入2mLBenedict试剂和4滴待测糖溶液，沸水浴中加热5分钟，取出后冷却，观察各管中的颜色变化。Ⅵ.Barfoed试验实验原理在酸性溶液中，单糖和还原二糖的还原速度有明显差异。Barfoed试剂为弱酸性。单糖在Barfoed试剂的作用下能将Cu2+还原成砖红色的氧化亚铜，时间约为3分钟，而还

7、原二糖则需20分钟左右。所以，该反应可用于区别单糖和还原二糖。当加热时间过长，非还原性二糖经水解后也能呈现阳性反应。试剂Barfoed试剂：16.7g乙酸铜溶于近200mL水中，加1.5mL冰醋酸，定容至250mL即可。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。操作方法取试管，编号，分别加入2mLBarfoed试剂和2~3滴待测糖溶液，煮沸2-3分钟，放置20分钟以上，比较各管的颜色变化。注意事项（1）Molish反应非常灵敏，0.001％葡萄糖和0.0001％蔗糖即能呈现阳性反应。因此，不可在样品中混入纸屑等杂物。当果糖浓度过高时，由

8、于浓硫酸对它的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈紫色，需稀释后再做。（2）果糖与Seliwanoff试剂反应非常迅速，呈鲜红色，而葡萄糖所需时间较长，且只能产生黄色至淡黄色。戊糖亦与Seliwa