生物化学实验指导(参考)1

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1、实验二、　紫外吸收法测定核酸的含量一、目的1、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。2、学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。二、原理核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（－C＝C一C＝C一），能够强烈吸收250～280nm波长的紫外光。核酸（DNA，RNA）的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的

2、摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH和离子强度发生变化。它们的经典数值（pH=7.0）如下：DNA的ε（ρ）=6000～8000RNA的ε（ρ）=7000～10000小牛胸腺DNA钠盐溶液（pH=7.0）的ε（ρ）=6600，DNA的含磷量为9.2%，含1μg/

3、mLDNA钠盐的溶液光密度为0.020。RNA溶液（pH=7.0）的ε（ρ）=7700～7800，RNA的含磷量为9.5%，含1μg/mLRNA溶液的光密度为0.022～0.024。采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定：在260nm波长下，浓度为1μg/mL的DNA溶液其光密度为0.020，而浓度为1μg/mL的RNA溶液其光密度为0.024。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3μg／mL的含量即可测出。

4、对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小，若样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质，测定误差较大，应设法事先除去。由于降解或水解作用，核酸的光密度可以增高约40％，这就是众所周知的增色效应（hyperchromiceffect）。在大分子的核酸中，氢键和π-键相互作用改变了碱基的共振行为。因此，核酸的光密度低于构成它的核苷酸的光密度，该现象称为减色效应（hypochromiceffect）。蛋白质和核苷酸也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的

5、吸收值仅为核酸的1∕10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA的260nm与280nm吸收的比值.在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品内混杂有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法事先除去。三、实验材料、主要仪器和试剂（一）试剂1．标准核酸溶液（酵母RNA或小牛胸腺DNA，用0.01NaOH溶液配制成500μg/ml溶液）2．待测核酸样品（二）器具1、紫外分光光度计2、微量注射器（50μL）3

6、、移液管3．试剂（1）5%～6%氨水：用25%～30％氨水稀释5倍。（2）钼酸铵-过氯酸试剂：取3.6mL70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中。四、操作步骤（一）核酸紫外吸收光谱的测定取100μL的RNA溶液于试管中，加入5mL蒸馏水，摇匀，测定核酸溶液在220～290nm波长范围的消光值，再用蒸馏水作空白调零。以该溶液在各波段的光吸收值（即A值）为纵坐标，波长为横坐标，绘制核酸的吸收光谱。（二）核酸溶液含量的测定将上述测吸收光谱溶液的A260直接计算溶液的RNA含量A260五、注

7、意事项如果待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则在测定时需加钼酸铵——过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液A值作为对照。六、思考题1．采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？2．若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？参考答案1．用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优点，并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质，产生较小测定误差。但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则会产生较大测定误差，需要设法事先除去。

8、2．当样品中含有核苷酸类杂质时，需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂处理，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260nm处光密度，以此作为对照；再从未加沉淀剂测得的样品液260nm光密度中扣除。实验三植物体内过氧化氢酶活性的测定一、目的过氧化氢酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力均有关系，故常加以测定。通过实验可了解过氧化氢酶的作用，并掌握测定过氧化氢酶活性的原理和方法。二、原理过氧化氢酶把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小，以一定时间内分解的过氧化氢量来表示