基因工程药物蛋白的分离纯化与质量控制

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1、重组基因工程药物的分离纯化及质量控制基因工程药物制造的一般流程：（1）获得目的基因；（2）组建重组质粒；（3）构建基因工程菌；（4）培养工程菌；（5）产物分离纯化；（6）除菌过滤；（7）半成品检定；（8）包装基因工程药物特点:(1)目的产物在初始原料中的含量较低;(2)含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大；(3)目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感

2、，容易是其失活、变性；种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物活性物质；应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源。目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。产物特性　　作用等电点　决定离子交换种类及条件相对分子量选择不同孔径的介质疏水性与疏水、反相介质结合的程度生物特异性决定亲和配基溶解性决定分离体系及蛋白浓度稳定性决定工艺采用温度及流程时间建立分离纯化工艺的根据建立分离纯化工艺的根据1、

3、含目的产物的起始物料的特点利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。（1）菌种类型及其代谢特性：包括菌种的生物学性质，产物和副产物种类、产物在细胞内所处的位置，表达方式（胞内、胞外、包含体），代谢物种类、产物类似物、毒素和能降解产物的酶类等；（2）原材料和培养基的来源及其质量；（3）生产工艺和条件：包括灭菌方式和条件，生产方式（连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工艺控制条件因素几方式等；（4）初始物料的物理、化学和生物学特性：包括产物浓度、主要杂质种

4、类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、黏度、流体力学性质和热力学性质。2、物料中杂质的种类和性质物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。3、目的产物特性产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活性等。4、产品质量的要求产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。包括允许的杂质种类和最

5、大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。特别注意3类可能存在的非蛋白质类杂质：（1）DNA的去除：在利用离子交换时，控制样液的pH值，使DNA不被吸附，而蛋白质可以被吸附；或利用亲和层析；（2）病毒的去除：成品中必须检查是否含有病毒。病毒最大的来源是由宿主细胞带入。经过色谱分离，一般能将病毒除去，必要时也可以用紫外线照射使病毒失活，或用过滤法将病毒去除。（2）热原的去除：热原主要是肠科杆菌科所产生的细胞内毒素，在细菌生长或细胞溶解时会释放出来，主要是细胞壁成份

6、－脂多糖，其性质相当稳定，即使经高压灭菌也不失活。注射用药必须无热原。从蛋白质溶液中除去内毒素比较困难，最好的办法是防止产生热原，整个生产过程要在无菌条件下进行，所有层析介质在使用前都要先除去热原，在2~8℃下进行操作。洗脱液需先经过无菌处理，流出的蛋白质溶液也应无菌处理，即经过0.2μm滤膜过滤。脂多糖带负电，可以用阴离子交换层析法去除；是疏水的，也可以用疏水层析法。基因工程药物分离纯化的一般流程发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离包涵体细胞碎片分离变性复性浓缩初步分离高度纯化制剂产品A重组基

7、因工程药物分离纯化方法选择的基因原则针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择分离纯化过程的规模化针对不同的产物表达形式采取不同的策略采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用融合型战略表达重组蛋白，拟首先选用亲和层析进行纯化表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放

8、重组蛋白。针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型等电点处于极端区域（pI≤5或pI≥8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是亲合层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应合适的范围内（10-8-10-4mol/L）；径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。疏水层析