人脂肪组织基质血管组分的分离培养

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1、人脂肪组织基质血管组分的分离培养作者：庄伟,谢良地,黄杰,许昌声【关键词】脂肪组织;细胞外基质；细胞,培养的　　ABSTRACT:ObjectiveToestablishamethodfortheisolationandcultureofstromalvascularfraction(SVF)ofhumanadiposetissueinvitro,cells.MethodsNormalhumanabdominalsubcutaneousadiposetissuemunofluorescenceassayinethepres

2、enceofthesurfacemoleculemarkerCD31andCD34.ResultsImmunofluorescenceassayshoethodcellsfromhumanadiposetissue,plicationofstemcells.　　KEYEMF12培养基(含HEPES,美国Gibico公司),胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS,杭州四季青生物技术有限公司),牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA,美国Amresco公司),CD31、CD34山羊源性单克隆抗体、猴抗山羊FITC

3、二抗(美国SantaCruz公司),L多聚赖氨酸、Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶(美国Sigma公司),25cm培养瓶(美国Constar公司)。　　1.2方法　　1.2.1脂肪组织取材在手术室无菌条件下,取正常体质量的腹部手术患者的腹部皮下脂肪,置于PBS缓冲液中。　　1.2.2脂肪组织消化剪取脂肪组织约500mg,剔除肉眼可见的血管及纤维部分,PBS冲洗3次,剪切成约1mm×1mm×1mm的组织块,移入酶消化液4mL中,内含1%BSA和0.1%Ⅰ型胶原酶,37℃消化60min,消化期间每间隔5min上下振荡1次。加入含15%胎

4、牛血清的DMEMF12培养基终止消化。　　1.2.3SVF处理　　1.2.3.1分离80目(75μm)网筛过滤组织消化液,去除未消化残余组织。将滤液移入新的10mL离心管,1800r/min离心10min,可见离心管内液体分为4层。先吸除表层的脂滴和次层乳状的成熟脂肪细胞,再吸弃第3层上清液体,留下底层沉淀物SVF。加入含15%胎牛血清的DMEMF12培养基1mL吹打重悬,计数。　　1.2.3.2接种培养在25cm培养瓶中预先置入含15%胎牛血清的DMEMF12培养基3mL,覆盖培养瓶底面,将重悬的SVF细胞悬液移入

5、培养瓶,细胞密度为20000cm-2。培养瓶置37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱培养。6h后换液,去除未贴壁细胞。此后每3天更换1次培养基。　　1.2.3.3传代约1周后,细胞融合达到70%～80%时,可以传代。吸弃上清培养液,用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液浸润1遍,吸弃,倒置相差显微镜下观察见细胞回缩,间隙增大,吸弃消化液即加入含15%胎牛血清的DMEMF12培养基终止消化,吸管轻柔吹打脱壁。移入10mL离心管,1800r/min离心5min,弃上清,加入含15%胎牛血清的DMEMF12培养基

6、1mL重悬。第2代细胞用于免疫荧光组织化学染色鉴定。　　1.2.3.4鉴定采用免疫荧光组织化学染色鉴定。SVF细胞接种于24孔板内L多聚赖氨酸预包被的盖玻片上,用于免疫荧光组织化学染色鉴定。室温下,37℃预热的PBS洗去培养基,4%多聚甲醛固定30min,PBS漂洗5min×3次。加入0.1%TritonX溶液,室温作用30min,PBS洗涤5min。正常4%BSA于37℃封闭20min。分别加入CD31、CD34山羊源性单克隆抗体(CD31检测内皮细胞,CD34检测干细胞),置4℃冰箱孵育过夜。PBS冲洗5min×3

7、次,加入猴抗山羊FITC二抗,37℃作用45min,PBS液漂洗5min×3次。荧光显微镜下拍照观察。以PBS取代一抗为阴性对照。　　1.3结果（1）细胞形态学。接种后细胞在6h内大部分贴壁,24～48h贴壁牢固。相差显微镜下,最初为小圆形,细胞大小不等,核浆比较大。2～4d后可见细胞伸展,核呈椭圆形,较大,之间混有少数形态、体积不一的细胞。绝大部分细胞的生长呈现明显的聚集性(图1)。原代细胞约1周左右可以达到70%～80%融合。常规传代后,第2代以后的细胞约4d左右即可以达到70%～80%融合。（2）免疫细胞学。第2代脂

8、肪SVF约有70％细胞呈CD31阴性,CD34阳性,表明具有干细胞的特性(图2)。　　SVF：脂肪基质血管组分.A:接种6h首次换液后第1代SVF,细胞贴壁,多呈小圆形,大小不等,核浆比较大;B:接种48h后第1代SVF,细胞较明显伸展;C:第2代SVF,细胞形态均匀,呈聚集性生长;D:第2代SVF,生