人脂肪组织基质血管组分的分离培养

《人脂肪组织基质血管组分的分离培养》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、人脂肪组织基质血管组分的分离培养作者：庄伟,谢良地,黄杰,许昌声【关键词】脂肪组织;细胞外基质；细胞,培养的　　ABSTRACT:ObjectiveToestablishamethodfortheisolationandcultureofstromalvascularfraction(SVF)ofhumanadiposetissueinvitro,whichhasthecharacteristicsofstemcells.MethodsNormalhumanabdominalsubcutaneousadiposetissuewasdigestedwithcollagenase

2、Ⅰandprecipitatedbycentrifuge.ThelowestlayercellsweresuspendedandculturedwithDMEMF12.ImmunofluorescenceassaywasusedtodeterminethepresenceofthesurfacemoleculemarkerCD31andCD34.ResultsImmunofluorescenceassayshowedthatabout70％ofthe2ndgenerationofculturedSVFcellswereCD34positive,butCD31negative

3、.ConclusionArapidreproduciblemethodwassetupfortheisolationandcultureofSVFwiththecharacteristicsofstemcellsfromhumanadiposetissue,whichpossessclinicaland9researchimplicationofstemcells.　　KEYWORDS:adiposetissue;extracellularmatrix;cells,cultured　　传统的干细胞多取材于胚胎、骨髓和脐血,在伦理和供体来源方面受到一定限制。脂肪组织中基质细胞有

4、多向分化潜能,可以作为干细胞的来源[1]。脂肪基质血管组分(stromalvascularfraction,SVF)即脂肪组织去除成熟脂肪细胞后,所获得的具有干细胞特性的基质细胞,相对而言有更大的优势。笔者探索更实用便捷、能够大量反复取样的SVF分离培养的方法,为人干细胞的研究寻求更便捷的来源,以期实现临床应用。　　1材料与方法　　1.1试剂DMEMF12培养基(含HEPES,美国Gibico公司),胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS,杭州四季青生物技术有限公司),牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA,美国Amresco公司),CD31、CD34山羊源性单

5、克隆抗体、猴抗山羊FITC二抗(美国SantaCruz公司),L多聚赖氨酸、Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶(美国Sigma公司),25cm培养瓶(美国Constar公司)。　　1.2方法9　　1.2.1脂肪组织取材在手术室无菌条件下,取正常体质量的腹部手术患者的腹部皮下脂肪,置于PBS缓冲液中。　　1.2.2脂肪组织消化剪取脂肪组织约500mg,剔除肉眼可见的血管及纤维部分,PBS冲洗3次,剪切成约1mm×1mm×1mm的组织块,移入酶消化液4mL中,内含1%BSA和0.1%Ⅰ型胶原酶,37℃消化60min,消化期间每间隔5min上下振荡1次。加入含15%胎牛血清的DMEMF12培

6、养基终止消化。　　1.2.3SVF处理　　1.2.3.1分离80目(75μm)网筛过滤组织消化液,去除未消化残余组织。将滤液移入新的10mL离心管,1800r/min离心10min,可见离心管内液体分为4层。先吸除表层的脂滴和次层乳状的成熟脂肪细胞,再吸弃第3层上清液体,留下底层沉淀物SVF。加入含15%胎牛血清的DMEMF12培养基1mL吹打重悬,计数。　　1.2.3.2接种培养在25cm培养瓶中预先置入含15%胎牛血清的DMEMF12培养基3mL,覆盖培养瓶底面,将重悬的SVF细胞悬液移入培养瓶,细胞密度为20000cm-2。培养瓶置37℃、体积分数为0.05的CO2

7、培养箱培养。69h后换液,去除未贴壁细胞。此后每3天更换1次培养基。　　1.2.3.3传代约1周后,细胞融合达到70%～80%时,可以传代。吸弃上清培养液,用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液浸润1遍,吸弃,倒置相差显微镜下观察见细胞回缩,间隙增大,吸弃消化液即加入含15%胎牛血清的DMEMF12培养基终止消化,吸管轻柔吹打脱壁。移入10mL离心管,1800r/min离心5min,弃上清,加入含15%胎牛血清的DMEMF12培养基1mL重悬。第2代细胞用于免疫荧光组织化学染色鉴定。　　1