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《锌对砷致大鼠睾丸损伤的保护作用以及睾丸金属硫蛋白的表达水平的分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、-表1BSA蛋白标准液的制备孔号12345678蛋白量（μl）01248121620双蒸水（μl）2019181612840（3）准备待测样品：样品1-20µl之内，蛋白质含量应所做标准曲线浓度范围之内；（4）加适量体积样品到96孔板中，加双蒸水到20µl；（5）各孔加入200µlBCA工作液，37℃放置30min；蛋白浓度低时可延长反应时间；（6）调酶标仪波长为A562nm，测各孔吸光度，根据标准曲线计算出蛋白浓度。（如图1）图1待测样品的蛋白浓度标准曲线Figure1Scatterplotofsampleproteincon
2、centrations4.6丙二醛(MDA)含量的测定----4.6MDA测定的原理过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA）可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。此法称为TBA法4.7MDA的测定步骤取样品按表2进行操作,然后用旋涡混匀器混匀,95℃水浴40min,取出后流水冷却,然后再以3000r/min离心10min,取其上清液用756PC紫外可见分光光度计在532nm处测定其吸光度。4.8MDA含量的计算按照下面的公式计算睾丸MDA含量，单位为：nmol/mgprotMDA的含量=测定OD
3、值-对照OD值×10nmol/ml÷待测样本蛋(nmol/mgprot)标准OD值-空白OD值（mgprot/ml）表2：测定MDA的加样步骤Table2MDAtestprocess空白管(ml)标准管(ml)测定管(ml)对照管(ml)10nmol/ml标准品（ml）0.1无水乙醇（ml）0.1测试样品（ml）0.10.1试剂一（ml）0.20.20.20.2充分混匀试剂二（ml）3333工试剂三（ml）11150%冰乙酸（ml）14.7超氧化物歧化酶(SOD)活力的测定4.7.1原理通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴
4、离子自由基,后者氧化羚胺形成亚硝酸盐,在显色剂的作用下呈紫红色,用紫外可见分光光度计测其吸光度。当被----测样品含SOD时,则对超氧阴离子自由基有专业性的抑制作用,使形成的亚硝酸盐减少,比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值,通过公式可求出被测样品中的SOD活力。4.6测定步骤取样品按表3进行操作,然后用旋涡混合仪充分混匀,室温放置10min后取反应液于96孔微孔板中，用酶标仪在450nm波长处测定其吸光度。表3：测定SOD的加样步骤Table3SODtestprocess对照孔对照空白孔测定孔测定空白孔待测样本（μl）2
5、020双蒸水（μl）2020酶工作液（μl）2020酶稀释液（μl）2020底物应用液（μl）200200200200混匀，37℃孵育20分钟，450nm处酶标仪读书4.7SOD活力的计算4.7血浆SOD活力计算4.7.1定义:在本反应体系中SOD抑制率达50%时所对应的酶量为一个活力单位（U）。4.8组织匀浆SOD活力计算按照下面公式计算SOD的抑制率：A（-对照SOD抑制率（%）=AＡＡ）-（-）对照空白测定测定空白×100％ＡＡ（-）对照对照空白按公式计算SOD的活力：----反应体系（.
/）=SOD抑制率÷%×
稀释倍
6、数（0.02ml）024ml）SOD抑制率（Umgprot50÷待测样本蛋白浓度（mgprot/ml）4.6谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力测定4.7GSH-Px测定的原理谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)可以促进过氧化氢(H2O2)与还原型谷胱甘肽(GSH)反应生成H2O及氧化型谷胱甘肽(GSSG),谷胱甘肽过氧化物酶的活力可用其酶促反应的速度来表示,测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗,则可求出酶的活力。GSH-Px的活力以催化GSH的反应速度来表示,由于这二个底物在没有酶的条件下,也能进行氧化还原反应(称非酶促反应)
7、,所以最后计算此酶活力时必须扣除非酶促反应所引起的GSH减少的部分。4.8GXP的测定步骤取样品按表4进行操作,然后用旋涡混合仪充分混匀,15min后取反应液用756PC紫外可见分光光度计在412nm处测定其吸光度。----表4：测定GXP的加样步骤Table4GXPtestprocess空白管标准管非酶管酶管1mmol/LGSH（ml）0.20.2待测匀浆（ml）0.237℃水浴预温5分钟试剂一应用液（ml）0.10.137℃水浴准确反应5分钟试剂二应用液（ml）22待测匀浆0.2混匀，3500-400转/分，离心10分钟，取
8、上清1ml作显色反应GSH标准品溶剂应用液（ml）120µmol/LGSH标注液（ml）1上清液（ml）11试剂三应用液（ml）1111试剂四应用液（ml）0.250.250.250.25试剂五应用液（ml）0.050.050.050.054.6GXP含量的计算
