免疫组化与原位杂交

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1、免疫组织化学和原位杂交Immunohistochemistry&Insituhybridization免疫组织化学前提条件：所使用的抗体必须能用于免疫组化。一、基本原理：利用抗体（antibody）与相应抗原（antigen）的特异性结合,通过与抗体连接的酶反应或荧光染料显示抗原所在的位置。二、常用于标记抗体的标记物一）酶（enzyme）1.辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）辣根过氧化物酶的作用物（底物，substrate）1）二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）显色特点：---棕色---不溶于水及脂类溶剂（酒精ethanol,二

2、甲苯xylene）---不扩散---永久保存2）3氨基9乙基卡巴唑（3-Amino-9-Ethylcarbazole，AEC）显色特点：---棕红色---不溶于水，但溶于脂类溶剂---容易扩散---不能永久保存3）4氯1萘酚（4-Chloro-1-naphthol，CN）显色特点：---蓝色---不溶于水，但溶于脂类溶剂---容易扩散---不能永久保存4）四甲基联苯胺（3,3‘,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB）显色特点：---深蓝色---不溶于水及脂类溶剂---不扩散---永久保存2.碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,AP）碱性磷酸酶的作用物（底物

3、，substrate）1）四唑淡蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(Nitro-Blue-Tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-inodlyl-phosphate,NBT/BCIP）显色特点：---紫色---不溶于水但溶于脂类溶剂---容易扩散---不能永久保存2）快红（固红/萘酚磷酸盐，FastRedTR/NaphtholAS-MX）显色特点：---桃红色---不溶于水但溶于脂类溶剂---容易扩散---不能永久保存3）快蓝（固蓝BB/萘酚磷酸盐，FastBlueBB/NaphtholAS-MX)显色特点：---蓝色---不溶于水但溶于脂类溶剂---容易扩散---不能

4、永久保存4）品红（品红/萘酚磷酸盐，Fuchsin/NaphtholAS-TR）显色特点：---红色---不溶于水及脂类溶剂---不扩散---永久保存DABFastblueFastredNBT/BCIPAEC二）荧光染料（fluorescentdye）常用的荧光染料1.异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）分子量为389，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，是目前应用最广泛的荧光素。2.四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,TMRITC）分子量

5、为444，最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光。3.羰花青类（carbocyaninedyes)荧光较强，不易淬灭，近年来应用广泛。4.AlexaFluor吸收光波及发射光波长范围广，也是目前应用最广泛的荧光素。三）生物素(维生素H,Biotin)水溶性维生素，属于维生素B族。相对分子量244，分子结构简单，通过其羧基与被标记物的氨基结合，可标记抗体、酶、激素、核酸、凝集素等，由于其分子小，不影响被标记物的理化和免疫学特性。极易于亲和素（Avidin）结合，形成亲和素-生物素复合物（Avidin-biotincomplex,ABC）因此，常与亲和素一起被用于免

6、疫组化的ABC方法中。四）胶体金（colloidalgold）又称金溶胶（goldsolution），是指分散相粒子直径在l—150nm之间的金溶胶，能稳定又迅速地吸附蛋白质，可以作为标记物标记抗体、抗原、激素、核酸等，在药物检测、生物医学等许多领域有广泛的应用，常用于透射电镜。三、组织标本的制备一）组织标本的取材取材原则:尽可能快的切取所需组织浸入固定液或快速冰冻,保持组织的新鲜以最大限度地防止抗原破坏和降解。二）固定（Fixation):根据所检测抗原的性质选择适当的固定液和固定方法，固定液用量应是标本的40倍。1.常用的固定剂(Fixativesolution)1）单纯固定剂①丙酮(Ac

7、etone)：主要用于新鲜组织冰冻切片的快速固定，以检测细胞表面抗原、自身抗体及细胞内外的免疫球蛋白。②甲醇(Methanol)：与丙酮相似。③乙醇(Ethanol):与丙酮相似。④甲醛(formaldehyde):使用最广泛的固定剂，有多种剂型，包括：福马林（formol）:即10%甲醛水溶液，最常用的固定剂，适用于各种组织固定。中性福马林：含过饱和碳酸钙（calciumcarbonate)的1