凝胶过滤层析法聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质分离纯化及鉴定

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1、凝胶过滤层析法聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质分离纯化及鉴定凝胶过滤层析法试验原理利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。凝胶层析的原理Kd=(Ve-Vo)/Vi优点条件温和操作简便损失少回收率高层析柱可反复使用凝胶及凝胶柱的选择根据不同分子量选择不同凝胶Sephadex:交联葡聚糖G-10，15，25，50，75，100，150，200；得水值X10Sepharose：琼脂糖凝胶Bio-GelABio-GelP：聚丙烯酰胺凝胶分子筛Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡

2、聚糖凝胶凝胶柱的选择凝胶的前处理溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。碱洗：用0.5MNaOH溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。酸洗：用0.5MHCl溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同。将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/4~1/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵入凝胶至沉降到所需高度。装柱时要注意操作压。用3-5倍柱床

3、体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平衡，柱床稳定。装柱样品上柱、洗脱、收集。如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶面沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。凝胶的再生及保存再生用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能凝胶的保存方法0.02%叠氮钠或0.002%双氯苯双胍己烷a.分离蛋白质b.脱盐c.蛋白质分子量的测定应用聚丙烯酰

4、胺凝胶电泳1．原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N，N-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素(VB2)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。1.1聚丙烯酰胺凝胶优点化学性能稳定，对pH和温度变化不敏感；重复性好；灵敏度高，可达10-6g；分辨率高。分子量范围适用的凝胶浓度/(%)10420-301-4×10415-201-5×104-1×105

5、10-151×1055-105×1052-5分子量范围与凝胶浓度的关系1.2凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关1.3种类连续系统与不目前常用的多为圆盘电泳(图1)和板状电泳(图2)，两者电泳原理完全相同。聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统两大类。图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3图2夹心垂直板电泳槽示意图1.样品槽模板2.长玻璃板1.导线接头2.下贮槽3.凹

6、形橡胶框4.样品槽模板5.固定螺丝6.上贮槽7.冷凝系统图3蛋白质微型电泳系统蛋白质微型电泳系统1.4不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。样品浓缩效应A.凝胶孔径不连续性B.缓冲体系离

7、子成分及pH值的不连续性C.电位梯度的不连续性分子筛效应电荷效应1.5不连续体系凝胶对蛋白的分离作用2.1SDS-不连续体系凝胶制备2.操作步聚试剂名称　　　　　分离胶(8%)　　浓缩胶(4%)分离胶缓冲液　　　　1.25ml/浓缩胶缓冲液　/0.5ml水　　　　　　　　　2.4ml1.2mlTEMED10ul5mlAP60ul25ul聚丙烯酰胺凝胶配制操作步聚2.2样品处理适量浓度蛋白溶液加入1×上样缓冲液混匀，95℃水浴中处理5分钟。2.3加样用微量进样器取10-15l上述混合液，通过电极缓冲液，小心地将样

8、品加到凝胶凹形样品槽底部。2.4电泳将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，打开电泳仪开关，开始时电流为10mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1cm时，停止电泳，关闭电源。2.5染色与脱色电泳结束后，取下凝胶模，卸下胶框，用凝胶铲小心撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，加入染色液染色1-2h，再用