hcv非结构蛋白3反式激活基因6转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析

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1、HCV非结构蛋白3反式激活基因6转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析邵清，成军，王琳，张健，卢成哲【关键词】丙型肝炎病毒ScreeningofgenesdifferentiallyexpressedinHepG2cellstransfectedicroarrayassay　　【Abstract】AIM:TostudythedifferenceingeneexpressioninhumanhepatoblastomacelllineHepG2cellstransfectedidandtofurtherelucidateitsmolecularbiological

2、mechanism.METHODS:Sequencespecificprimersentplifiederasechainreaction(PCR)techniqueusingpBRTM3011plasmidcontainingthefulllengthofHCVHcDNAasthetemplate.TheexpressionvectorofpcDNA3.1(-)NS3TP6olecularbiologicalmethods.cDNAmicroarraytechnologyployedtodetectthemRNAfromtheHepG2cellstran

3、sfectedrespectivelyine.RESULTS:TheexpressionvectoredbyrestrictionenzymedigestionandDNAsequencinganalysis.TheexpressionofNS3TP6proteinedby109为本室保存；pcDNA3.1(-)真核表达载体购自Invitrogen公司；LipofectaminePLUS转染试剂购自Gibco公司，mRNA提纯试剂盒为AmershamPharmacia公司产品；PCRSelectcDNASubtraction试剂盒，50×PCREnzyme

4、Mix，AdvantagePCRCloning试剂盒购自Clontech公司；HighPurePCRProductPurification试剂盒购自BoehringerMannheim公司；T7，SP6通用引物及pGEMTeasy载体为Promega公司产品.cDNA的基因芯片由上海联合基因有限公司提供.　　1.2方法　　构建NS3TP6蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)NS3TP6，用LipofectaminePLUS转染试剂将2μgpcDNA3.1(-)NS3TP6及pcDNA3.1(-)空载体分别转染35mm平皿HepG2细胞，48h后收获细胞.

5、使用mRNAPurification试剂盒，直接提取转染了NS3TP6表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA，经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计进行定性、定量分析.参照Schena等的方法逆转录标记cDNA探针并纯化.Cy3dUTP标记对照组细胞mRNA（5μg），Cy5dUTP标记实验组细胞mRNA（5μg）.乙醇沉淀后，溶解于20μL的含0.2g/LSDS和5×SSC的杂交液中.包含的1152个cDNA的基因芯片，包括原癌基因和抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等.以通用引物进行PCR扩增，PCR产物长度为1000

6、～3000bp.靶基因以0.5g/L溶解于3×SSC溶液中，用Cartesian公司的Cartesian7500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样.玻片经水合（2h）、室温干燥（0.5h），紫外线（UV）交联，再分别用0.2g/LSDS、水及0.2g/L的硼氢化钠溶液处理10min，晾干备用.将基因芯片和杂交探针在95℃水浴变性5min，将混合探针加在基因芯片上，置于60℃杂交15～17h.依次以2×SSC+0.2g/LSDS,0.1×SSC+0.2g/LSDS,0.1×SSC洗涤10min，室温晾干.用GeneralScanning公司的S

7、canArray3000扫描芯片.用预先选定的内参照基因（24条管家基因，每个基因点2个点，共48个点）对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正.用ImaGene3.0软件分析Cy3,Cy5两种荧光信号的强度，计算Cy5/Cy3比值.阳性结果判断：Cy5/Cy3＞2.0，红色荧光，显示表达增强；Cy5/Cy3＜0.5，为绿色荧光，显示表达减弱.　　2结果　　总RNA的吸光度A260nm／A280nm>1.89，热稳定实验70℃保温1h与-20℃1h电泳条带比较，显示28S条带无明显降解，电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA.mRNA主要集中于0.9

8、～4.0kb的连续条带.在基因芯片的扫描分析中，如果荧光染料的Cy