螺旋藻激酶对大鼠动静脉环路血栓的溶栓作用研究

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1、螺旋藻激酶对大鼠动静脉环路血栓的溶栓作用研究庞辉，李小花，陈高斯，凌凯南，王保斌，张崔勇，黄家俍，刘庆，朱召熊，安明，蒙莲【摘要】目的探索螺旋藻激酶(SPK)对大鼠动静脉环路血栓的溶栓作用及其机制。方法采用大鼠颈动-静脉环路血栓模型,通过称取血栓重量来测定螺旋藻激酶的溶栓作用;腹主动脉取血分离血浆，测定螺旋藻激酶对血浆D二聚体、TPA含量的影响。结果螺旋藻激酶使动静脉环路血栓干、湿重明显减轻，高、低剂量螺旋藻激酶使血浆D-二聚体含量明显升高(P均0.05)，高剂量螺旋藻激酶使TPA含量明显升高(P0.05)。结论螺旋藻蛋白激酶能

2、抑制血栓形成,激活纤溶活性,具有较好溶栓效力。【关键词】螺旋藻蛋白激酶;颈动静脉血栓形成;血栓溶解血栓性疾病是临床常见病，严重地危害人们的健康，寻找具有抗凝和溶栓作用的物质对防治血栓性疾病具有广泛的临床实用价值。螺旋藻(Spirulina)是一种水生植物,广泛分布于中国广西、福建、浙江、云南、海南等省区，具有增强免疫力、抗辐射、抗疲劳等药理作用，它现在已经被开发出具有多种功效的天然绿色保健品[1]。我们首先从螺旋藻的发酵物中发现一种具有溶解纤维蛋白作用的蛋白激酶类活性成分，我们称它为螺旋藻激酶(SPK)，本试验主要使用螺旋藻激酶

3、提取液观察它对大鼠动静脉环路血栓的溶栓作用及其溶栓机制，为开发廉价有效的治疗血栓性疾病的药物提供实验依据。　　1器材与方法　　1.1药品与试剂肝素钠注射液(天津市生物化学制药厂061226);纤维蛋白原冻干粉(24mg广西医科大学实验中心蛇毒所研制)、凝血酶(由中国药品生物制品所提供),TPA含量测定试剂盒(上海太阳生物技术公司)，尿激酶(丽珠集团丽珠制药厂，批号国药准字H44020645，产品批号060701),其他均为国产分析纯。　　1.2SPK粗酶提取物的制备按照螺旋藻激酶粉[由北海市康福保健食品有限公司提供，经广西测试中

4、心检测其蛋白激酶含量为6000FU(活力单位)/g]10g粉剂溶于100ml生理盐水的比例混匀，以3000r/min离心10min，取一定体积上清液搅拌加入饱和硫酸铵溶液，然后以8000r/min低温离心20min后，依次分别获得0～15%，15%～35%，35%～45%，45%～55%，55%～65%，65%～75%饱和度的蛋白质沉淀，用三蒸水溶解，倒入透析袋，置于冰箱中进行透析，除去硫酸铵，然后置于低温冷冻干燥机中干燥得各段盐析产物的粉剂。取各段盐析产物在琼脂糖-纤维蛋白平板上进行溶圈实验，取纤溶活性高的部分为SPK提取物。

5、　　1.3动物与仪器g/ml)、低剂量组(0.3mg/ml)，生理盐水阴性对照组及尿激酶阳性对照组(2000μl/ml)，大鼠以20%氨基甲酸乙酯0.5ml/100g腹腔麻醉，由股静脉按0.5ml/100g推药，参照文献制作动静脉环路血栓模型，分离右侧颈总动脉及左侧颈外静脉，并将两根用肝素生理盐水(25U/ml)处理的聚乙烯管分别插入颈总动脉及颈外静脉，在动-静脉旁路的连接管内插入一段长8cm的钢丝，用药后40min开放动脉静脉环路15min，中断血流形成血栓[2，3]。　　2.2动静脉环路血栓测定用药后40min开放动脉静脉环

6、路15min，中断血流形成血栓后迅速取出包裹钢丝的血栓称重，并减去钢丝重量，即得血栓湿重，并求出其血栓抑制率。在70℃干燥箱中1h后，待其冷却后称取干重，求出血栓抑制率[2]。　　2.3血浆D二聚体和TPA含量的测定腹主动脉取血及分离得到血浆，在广西医科大学第一附属医院检验科测定D二聚体含量，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血浆TPA的含量。　　2.4统计学处理数据处理所测数据由作者采用SPSS10.0软件经计算机处理,统计结果以±s表示,组间差别显著性用t检验判定。　　3结果　　3.1SPK对大鼠动静脉环路血栓形成重量的

7、影响结果显示，SPK有抑制动静脉环路血栓形成的作用，使血栓形成的湿重及干重明显减轻，与对照组比较有显著性差异，且呈量效依赖关系。结果见表1。表1SPK对大鼠动静脉环路血栓形成重量的影响　与生理盐水组比较，*P0.05;n=10　　3.2SPK对大鼠血浆D二聚体和TPA的含量的影响结果显示，高、低剂量SPK均使D二聚体含量显著增加，高剂量SPK使TPA含量显著增加，且从数值上看，有剂量效应依赖关系。结果见表2。表2SPK对大鼠D二聚体和TPA的含量的影响　　4讨论　　螺旋藻激酶(SPK)是利用液体发酵的技术从螺旋藻生产出的蛋白酶，

8、前期我们研究发现SPK有较高的溶栓活性。本实验我们验证其体内溶栓活性，实验结果表明SPK可抑制动静脉环路血栓，使血栓形成的湿重及干重明显减轻，与对照组比较有显著性差异，且呈量效依赖关系。血栓是血液中纤维蛋白多聚体与细胞组成的复合物，血栓溶解的中心环节在于纤维蛋白