原位杂交检测bclxlmrna在血管瘤组织中的表达及意义

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1、原位杂交检测BclxlmRNA在血管瘤组织中的表达及意义【摘要】　　目的：探讨Bclxl在血管瘤发生发展中的作用及其临床意义。方法:采用原位杂交方法检测人皮肤血管瘤增生期、退化期及正常皮肤组织血管内皮细胞的BclxlmRNA表达水平,利用图像分析技术检测不同时期血管瘤和正常皮肤组织的阳性面积率和平均光密度。结果:增生期血管瘤内皮细胞BclxlmRNA表达水平明显高于退化期及正常皮肤组织,差异有显著性意义(P<0.01)；退化期与正常皮肤组织血管内皮细胞BclxlmRNA表达水平差异无显著性意义(P>0.0

2、5)。结论:Bclxl在血管瘤的发生、发展过程中起了重要作用。【关键词】Bcl－xlmRNA血管瘤原位杂交阳性面积率　平均光密度　　血管瘤是好发于婴幼儿的一种常见良性血管肿瘤。内皮细胞过度增生是血管瘤的特征性病理改变，也是血管瘤发生、发展及其演变的实质。根据血管瘤内皮细胞的生物学特点并结合临床，可将血管瘤的自然病程分为增生期、退化期和退化完成期。目前，血管瘤的发生、发展和退化机制尚未完全阐明。现有研究发现，内皮细胞增殖状态的改变、多种血管形成因子和血管形成抑制因子在血管瘤不同时期表达水平的变化以及内皮细胞增殖与凋亡的不平衡与

3、血管瘤的发生、发展和退化有密切关系。目前的实验研究中，尤其引人关注的焦点之一是血管瘤自发消退的机制。Bclxl属于抑凋亡基因，是比较重要的癌基因，它与血管生成有一定关系。有关Bclxl基因蛋白在恶性肿瘤中的研究较多，而在血管瘤组织中的研究国内外尚未见报道。本课题应用原位杂交方法对增生期、退化期血管瘤和正常皮肤血管组织中BclxlmRNA的表达进行了检测，旨在探讨其与血管瘤发生、发展的关系及其分子机制。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1材料来源　　收集武汉大学人民医院病理科2002～2006年皮肤血管瘤存档蜡块4

4、0例，其中男性20例，女性20例。血管瘤所在的部位主要有头皮、前额、眼睑、耳背、颈部、背部、上臂、大腿、手和足的皮肤等。患者术前均未做任何辅助性治疗。　　1.1.2材料分组　　蜡块切片厚5μm，贴片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上，置于烤箱烤干待用。常规HE染色，按Mulliken分类标准并结合PA的表达进行分组：增生期血管瘤22例，退化期血管瘤18例，另取瘤组织周围正常皮肤组织5例作对照。　　2方法　　2.1常规HE染色取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。　　2.2原位杂交检测BclxlmRNA的表达①组织切片常规脱蜡至

5、水②3%H2O2室温处理10min以灭活内源性过氧化物酶③切片上滴加胰蛋白酶37℃消化25min④按每张切片加20μl含生物素标记寡核苷酸探针的原位杂交液，37℃恒温过夜进行杂交⑤洗脱后滴加封闭液37℃，20min⑥滴加SAHRP37℃处理20min⑦DAB显色，脱水，透明，封片用PBS代替含寡核苷酸探针的原位杂交液作为阴性对照组，人扁桃体作为阳性对照组。　　2.3免疫组织化学结果判断原位杂交细胞膜或胞浆呈蓝色为BclxlmRNA阳性，阴性对照组应无蓝色反应物。采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济

6、千屏影像公司）对BclxlmRNA的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。　　2.4统计学处理对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNKq检验，检验水准α为0.05。　　3结果　　3.1HE染色正常皮肤组织中的毛细血管由1到2个内皮

7、细胞围成，管壁较薄，内皮细胞胞质薄，仅含核的部分略厚，内皮细胞核扁平。增生期血管瘤组织中可见内皮细胞增生呈团索状，内皮细胞核肥大而淡染；内皮细胞有的围成血管腔，有的不围成血管腔而呈团块状。退化期血管瘤组织中可见内皮细胞数量减少，内皮细胞核扁平；血管腔增大，血管间结缔组织增多。有时在同一个标本中，可以同时见到典型的增生期和退化期区域。　　3.2原位杂交增生期血管瘤内皮细胞胞膜和胞浆有较密集蓝色颗粒；退化期血管瘤内皮细胞胞膜和胞浆蓝色颗粒不明显；正常皮肤组织血管内皮细胞胞膜和胞浆无蓝色颗粒沉积。图像分析及统计分析结果见表1。表1血

8、管瘤不同时期BclxlmRNA表达的平均光密度和阳性面积率（略）　　4讨论细胞凋亡与肿瘤的关系是近年来的研究热点之一,细胞凋亡的失控是导致肿瘤发生发展的重要方面,其中Bcl2家族备受重视。Bcl2、BclxL和Bax是该家族中的重要成员,它们主要通过线粒体途径参与凋亡