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时间:2018-11-29
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1、痰液标本细菌学检验(一)关键词:细胞库菌株培养中心atcc北京标准物质网一、检验程序痰及呼吸道标本的细菌学检验程序见图34—1。二、检验方法(一)显微镜检查1.一般细菌涂片检查 挑取标本中脓性或带血部分涂片进行革兰染色镜检,描述观察到的细菌的染色性、形态及排列等特征,可发出初步报告。2.结核分枝杆菌涂片检查 挑取标本干酪样或脓性部分做抗酸染色和金胺“O”荧光染色,前者用油镜,后者用荧光显微镜检查。具体操作详见第十五章分枝杆菌属检验。3.放线菌及诺卡菌涂片检查 将痰液用生理盐水反复洗涤数次,挑取黄色颗粒(硫黄颗粒)或不透明着色斑点,置玻片上并覆以盖玻片,轻压后置高倍镜下观察。如见中央为
2、交织的菌丝,其末端粗杆呈放线状排列时揭去盖玻片,待干后做革兰染色及抗酸染色镜检。4.下呼吸道其他标本检查 支气管肺泡灌洗液等直接取自下呼吸道的标本,不易受上呼吸道杂菌的污染,涂片检菌的意义较大。可取离心沉淀物进行革兰染色与抗酸染色检查。(二)培养和鉴定1.痰培养标本的前处理 于痰标本中加入一定量无菌生理盐水,剧烈振荡5~10秒后,将沉淀于管底的脓痰小片取出,置于另一试管中,同法再处理2次,可洗去痰中的正常菌群。然后向洗涤过的痰液中加入等量pH7.6的1%胰酶溶液,放置35℃环境90分钟,使痰液均质化后备用。2.培养基与培养环境(1)血琼脂平板:适用于分离多种细菌,需氧环境,可分离β-
3、溶血性链球菌,葡萄球菌;置于5%CO2环境培养,分离肺炎链球菌和β-溶血性链球菌。根据血琼脂平板生长的菌落特征及镜检形态,得出初步结果,再按各类细菌特性做进一步鉴定。(2)巧克力色琼脂平板:置于5%CO2环境培养,常用于分离嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌等有特殊营养需求的细菌。(3)中国蓝琼脂平板/麦康凯平板:需氧环境培养,常用于分离肠杆菌科细菌。(4)TTC-沙保弱培养基:需氧环境培养,用于分离白假丝酵母菌及其他酵母菌、诺卡菌、放线菌以及烟曲霉菌等。(5)厌氧血平板:厌氧环境培养,用于培养厌氧菌。(6)结核分枝杆菌培养基:需氧或5%~10%CO2环境培养,改良罗氏培养基、米氏7H10培养基
4、或其他合适的培养基,用于培养结核分枝杆菌。(7)军团菌专用培养基:置于2.5%~5.0%CO2环境培养,药用炭酵母琼脂(CYE)培养基、F-G琼脂,用于培养军团菌。3.标本的培养(1)普通细菌培养:将处理后的痰标本接种于血琼脂平板、中国蓝琼脂平板/麦康凯平板、巧克力色琼脂平板上,分别放入普通环境和5%~10%CO2环境中,35℃培养18~24小时,观察菌落特征,并涂片进行革兰染色,根据菌体的形态特点做进一步鉴定。有条件或必耍时进行厌氧培养。具体操作详见第十七章厌氧性细菌检验。(2)结核分枝杆菌培养:将处理后的痰标本接种于改良罗氏培养基或米氏7H10培养基,置35℃、5%~10%CO2
5、环境中培养。根据初步生长出菌落时间和是否产生色素等特点,加以判定。(3)标本的菌落计数培养:液体标本,如保护性支气管肺泡灌洗吸出液(PBAL)、气管穿刺抽吸液(TTA)、保护性标本刷洗液(PSB)标本或定量稀释均质化处理的痰标本,可做菌落计数培养。常用的改良Gould法是一种半定量的方法,先将平皿分为A、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等4个区,阻3mm接种环取一满环液化痰液(或定量采集的PBAL、TTA、PSB)接种于血琼脂平板或巧克力色琼脂平板,先在A区画线20~40条,然后在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区分别画线4条。在做Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分区画线前,接种环均须经烧灼灭菌。接种后的培养基置35℃培养18~20小时,然后分别计
6、数各区某一特征的菌落数,查阅表34—3即得出每毫升痰液中某一特征菌落细菌的对应数量。一般认为痰液标本中,某种细菌浓度达到≥107CFU/ml,可视为病原菌;<104,可视为污染菌;若介于105~106CFU/ml两者之间时,要连续分离培养两次阻上,仍为105~106CFU/ml时,亦认为是病原菌。例如:一份痰标本,经均质化处理过程已经进行了1:16倍稀释,按上述菌落计数方法操作,培养24小时后,某一特征最优势菌落Ⅰ区生长5个(相当于90个),查表对应于10000行,计算(×103)得菌落数≥107CFU/ml,由此可以判断该特征菌落为病原菌。提倡做菌落计数培养有两方面原因,其一,有的
7、标本中细菌数量可能较少,需通过茼落计数判断是否足以引起化脓性感染;其二,有的标本污染正常菌群的可能性较大,需通过菌落计数判断哪一种菌落是引起化脓性感染的病原菌。痰标本细菌菌落计数培养还没有列入统一规范,供做参考。
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