细胞端粒酶活性定量检测在良恶性胸腹水中鉴别诊断的价值

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1、细胞端粒酶活性定量检测在良恶性胸腹水中鉴别诊断的价值作者：岳志红张正马丽平潘秀【关键词】细胞端【摘要】目的探讨端粒酶活性检测对良恶性胸腹水中的鉴别诊断的价值。方法采用TRAP-银染定性法和TRAP-PicoGreen定量法，对102例患者胸水和腹水进行端粒酶活性分析。结果端粒酶定性和定量结果均显示恶性组端粒酶活性水平显著高于良性组（P<0.05），定量检测细胞端粒酶活性和定性检测相比，可提高肿瘤检测的敏感性。结论端粒酶活性定量检测有助于良恶性胸腹水的诊断和鉴别诊断。关键词端粒酶胸水腹水肿瘤.【Abstract】ObjectiveTostudy

2、ontheclinicalvalueoftelomeraseactivityinascites/pleuraleffusions.MethodsThetelomeraseactivityinascites/pleuraleffusionsensofeffeusioncellsbyTRAP-PicoGreenassayandtheresultsofdetectingtelomeraseactivityeraseactivityinmalignantgroupseraseactivityintheeffusionscanbeapromisingdiag

3、nosticmethodindifferentialdiagnosisofbenignandmalignantascites/pleuraleffusions.Keyeraseactivitypleuraleffusionascitestumor正常细胞中端粒随细胞分裂呈进行性缩短，端粒酶是一种逆转录DNA合成酶，具有使端粒延伸并维持其稳定的作用。它的激活可稳定端粒长度甚至使细胞获得永生。由于大多数恶性肿瘤及细胞株端粒酶活性高表达，因此端粒酶是目前已知的最通用的肿瘤分子标志物。本文采用TRAP-PicoGreen方法定量检测了102例胸水和腹水标本

4、中端粒酶活性，探讨其在鉴别良恶性胸腹水中的诊断价值。1资料与方法1.1病例选择本院和北大医院自2003年3月～2004年1月102例患者的胸水和腹水标本。恶性组60例，男25例，女35例，年龄32～90岁，其中肺癌23例，卵巢癌15例，肝癌6例，乳腺癌6例，子宫内膜癌3例，胃癌2例，直肠癌、恶性横纹肌瘤、白血病、胰腺癌、膀胱癌转移各1例。见图1。良性组42例，男27例，女15例，年龄15～91岁，其中结核性21例（结核性胸膜炎20例，结核性腹膜炎1例），肝硬化7例，肺炎6例，肾衰4例，心衰2例，脊髓炎1例，腹膜浆液性囊肿瘤1例。所有病例诊断均经病理

5、学和（或）影像学证实。胸水收集前2～3周患者均未接受化疗。阳性对照k562细胞由本院中心实验室提供。体液脱落细胞病理学诊断由本院和北大医院病理科提供。1.2方法1.2.1细胞端粒酶提取取新鲜胸水或腹水标本100ml，对混有红细胞的血性标本加入红细胞裂解液摇匀，室温静置20min。4℃3000rpm离心10min，弃去上清，反复裂解3次，直至细胞变白。加入DEPC处理过的PBS洗涤，4℃3000rpm离心10min，弃上清，反复2次。加入预冷的细胞裂解液100μl，其中PMSF单独加入1μl，冰浴30min。4℃16000rpm离心20min吸取上清

6、置-70℃保存备用。1.2.2蛋白浓度测定（Branford法）以牛血清白蛋白（BSA）配制标准蛋白溶液。分别取20μl加入1000μl考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlueG-250）蛋白反应液，混匀，室温静置2min后在分光光度计595nm测定光吸收值。以蛋白浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线，线性范围为0～1.5μg/μl。即可相应测定标本的蛋白浓度。该方法为定量端粒酶的基础。1.2.3TRAP扩增在50μl反应体系中加入反应液40μl，标本7.5μl（蛋白含量最高为6.0μg）后，于30℃反应60min，进行底物延

7、伸。在延伸后产物中加入ACX引物2μl、Taq酶2.5单位、液体石蜡40μl，94℃预变性5min后循环25周，循环条件为变性（94℃）30s、退火（50℃）30s、延伸（72℃）90s，72℃后延伸10min后中止反应。每次TRAP反应时以k562细胞株1μg蛋白提取液作为阳性对照，不加标本提取液为阴性对照。1.2.4扩增产物检测1.2.4.1定性检测将10μlTRAP产物与含溴酚蓝的6×凝胶载样缓冲液2μl混合，在120V的电压下，进行12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，直至电流使溴酚蓝色带泳出凝胶为止。固定银染显色后，出现4条以上间隔6bp的梯度

8、条带者为端粒酶活性阳性，否则为阴性。1.2.4.2定量检测取TRAP产物4μl，加入PicoGreen工作液200μl混匀