人髂骨生长板软骨细胞的体外培养及鉴定

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1、人髂骨生长板软骨细胞的体外培养及鉴定.L.编辑。【摘要】探讨人髂骨生长板软骨细胞体外培养的可行性并观察其生物学特征。［方法］对手术中获得的10例青少年特发性脊柱侧凸患者髂骨生长板软骨行体外分离、培养，观察细胞形态，MTT法测定细胞增殖，Ⅱ型胶原免疫组化染色，采用逆转录聚合酶链反应检测各代细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达水平。［结果］（1）体外培养的软骨细胞随着传代次数的增加，细胞形态由原代的多角形逐渐变为长梭形；（2）MTT比色法检测显示，第2代髂软骨细胞的生长曲线近似倒“S”形，在第4～8d细胞呈对数生长，在9～10d达平台期，至第11d开始出现生长抑制。（

2、3）第2代细胞Ⅱ型胶原免疫组化呈强阳性。（4）Ⅱ型胶原mRNA表达水平从第2代后随着传代次数的增加逐渐下降。［结论］采用联合酶序贯消化法将软骨细胞悬液和软骨块共同体外培养髂软骨细胞简单、有效，P2代细胞很好的保持了软骨细胞的特性，可以作为种子细胞来源。【关键词】软骨细胞单层培养物学特性脊柱侧凸Abstract:［Objective］Toestablishaviableandconvenientmethodforhumaniliacgro10humaniliacgroonolayerandpassagedtoobservethechangesofcellm

3、orphology.Thegroetric.ImmunocytochemistryandRT-PCRedtoinvestigatetheexpressionofcollagenⅡattheprotEinandmRNAlevel,respectively.［Result］(1)Thephenotypeofchondrocyteoriginalpolygonalshapetofusiformat4thpassage.(2)MTTtestshoicgrostageat9th～10thday,anddecreasedatthe11thday.(3)Thecoll

4、agentypeⅡimmunohistochemicalstainingedthatthemRNAleveldecreasedodifiedmethodoftheenzymatictpleprocedure.Thesecondpassagecellsmaintainthephenotypeofchondrocyteonolayerculture;biologicalcharacteristics;scoliosis软骨细胞体外培养对于研究骨形成机理、骨骼系统疾病发病机理具有重要的意义，同时也可为组织工程提供种子细胞，是进行骨科相关领域基础研究的一项重要技

5、术。其体外培养受培养条件、取材部位、研究对象年龄等多因数的影响，细胞活力、增殖能力、去分化能力差异明显［1、2］。众多研究的取材偏向于年龄较小的肋软骨、关节软骨、鼻中隔软骨等［3、4］。而人髂骨生长板软骨的体外培养，鲜有报道。本实验对软骨细胞体外培养传统方法进行改良，用以培养青少年髂骨生长板软骨，并对其生物学特征进行鉴定，以探讨作为种子细胞的可行性。1资料与方法1.1一般资料青少年特发性脊柱侧凸(adolescentidiopathicscoliosis，AIS)患者后路矫形手术时获得髂骨生长板软骨10例，全部为女性；年龄12～14岁，平均13.1岁，C

6、obb’s角44°～70°，平均53.2°，其中LenkeⅠ5例，LenkeⅡ1例，LenkeⅢ2例，LenkeⅤ2例。1.2主要仪器与试剂DME培养液(pH7.2,Gibco)，胎牛血清(FBS,Gibco)，0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco),Ⅱ型胶原酶(Gibco)，双抗(青霉素、链霉素)（sigma），Ⅱ型胶原一抗、二抗（北京中杉金桥），DAB显色液(北京中杉金桥)，TrizolReagent(Invitrogen)，RT-PCR试剂盒(Invitrogen)，琼脂糖(Promega)，CO2细胞培养箱(NAPCO)，倒置相差显微镜及照相

7、系统(Olympus)。1.3细胞分离和培养术中取得的标本置于预装PBS离心管中，立即送入实验室，在超净台内仔细去除软骨周围的韧带及结缔组织，将软骨块剪至1mm×1mm×1mm大小，采用两步酶消化法(0.25%胰蛋白酶-EDTA消化30min、0.2%Ⅱ型胶原酶消化4～6h)消化后，收集细胞并计数，台盼蓝试验测定细胞活性后，将未完全消化的软骨块及软骨细胞共同接种于含10%FBSDMEM培养皿中，在5%CO2培养箱中，饱和湿度、37℃条件下培养，每3～4d换液一次，待细胞近融合时，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化2～3min，计数后按1∶3或1∶4传代。1

8、.4观察指标1.4.1细胞形态学培养的软骨细胞在倒置显微镜下观察细胞形态的变化并