凹叶厚朴茎段愈伤组织诱导中的褐变控制研究

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1、凹叶厚朴茎段愈伤组织诱导中的褐变控制研究【摘要】目的研究愈伤组织诱导过程中的褐变问题。方法：将采集的标本进行外植体灭菌法再接种到培养基，在培养基中加抗褐变剂，进行防褐变试验。结果外植体在4℃冰箱冷藏48h的预处理对褐变有较好的控制效果。在培养基中加入抗褐变剂比加入吸附剂抗褐变效果好，抗褐变剂中Vc的效果最佳，吸附剂PVP比活性炭好。结论培养条件，以低温遮光处理效果较好，光、温两个因素中，凹叶厚朴对光敏感，遮光能有效抑制褐变。液体浅层静置培养10d后转入固体培养抗褐变的效果比单纯的固体培养效果好。【关键词】凹叶厚朴；茎段；愈伤组织；褐变控

2、制；冷藏外植体；抗褐变剂；吸附剂；液体浅层静置培养〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕ＯｂｊｅｃｔｉｖｅTostudythebrofragmentsasexplantsduringinducingthecallus.MethodTheexplantediuminediumedium;VitaminCaterialinallanti-broperatureiseffectiveforthetissuecultureconditions,Maganoliabiloba（Rehdetoreeffectiveintheshallofragment;callus

3、;broaterials;adsorbent;shallog/L+6-BA1mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8~6.0。每次处理10瓶，每瓶5个外植体，外植体大小约为0.6cm×0.6cm。1.2方法1.2.1外植体灭菌预处理后的材料用75%乙醇消毒30s，再用0.1%升汞溶液浸泡10min，无菌水冲洗4次，吸干，在PVP1g/L溶液中切割，接种到培养基上。1.2.2防褐化试验分4个方面分别进行，即：外植体预处理、培养基中加入防褐变剂或吸附剂、培养条件、固体培养和液体浅层静置培养后再固体培养。外植体预处理：用洗衣粉清洗，自来水冲洗1h

4、，沥干后，保鲜膜密封置于4℃的冷藏箱分别冷藏24、48h，设对照为不冷藏。培养基中加抗褐变剂和吸附剂试验：培养基中加入Vc（10mg/L）、LH（1g/L）、巯基乙醇（1mL/L）、PVP（1g/L）、活性炭（2g/L）。培养条件试验：①低温遮光处理（20℃，遮光20d后，转入25℃及光下，光强1500LX）；②遮光处理（25℃，遮光20d，转入25℃及光下，光强1500LX）；③对照(25℃，每天光照10h，光强1500LX）。培养基：固体培养，在配好的培养基中加入6.5g/L的琼脂；液体浅层静置培养，不加琼脂，瓶内培养基深度约为0.

5、4cm，培养10d后，转入固体培养基中。计算方法：诱导率=（形成愈伤组织的外植体块数/接种的外植体块数）×100%。褐变率=（褐变的外植体块数/接种的外植体块数）×100%。2结果2.1外植体预处理对褐变的影响由表1可看出预冷处理有降低褐变的效果，使褐变率从对照的45%降低为30%~35%。冷藏时间48h比24h好。2.2培养基中加抗褐变剂和吸附剂对褐变的影响表2结果看出，抗褐变剂和吸附剂能很明显的防止外植体的褐变，而且抗褐变剂的效果比吸附剂好，前者褐变率为10.5%~18%，后者达到20.5%~25.5%。2.3培养条件对褐变的影响表

6、3实验中，低温遮光处理与遮光处理的抑制褐变率相差不大，而两者与对照比较，都有较大的差异。由表3的结果看来，在20~25℃之间，凹叶厚朴茎段愈伤组织的诱导对温度要求不严格，而对光敏感。2.4固体培养基和液体浅层静置培养由表4的结果来看，液体浅层静置培养一段时间后再转入固体培养基中比单纯固体培养基中的效果要好。3结论本文从4个方面考察了不同处理对凹叶厚朴茎段诱导愈伤组织中褐变的影响：（1）外植体在4℃冰箱冷藏48h的预处理对褐变有较好的控制效果，这可能与低温状态下，细胞内多酚氧化酶活性降低以及酚类化合物合成减少有关。（2）在培养基中加入抗褐

7、变剂和吸附剂，抗褐变剂的效果比吸附剂好，抗褐变剂中Vc的效果最佳，其作用机制主要是通过将多酚氧化酶（PPO）作用下形成的醌类物质重新还原为酚而减轻褐变[2]61-62，这与前人的试验结果一致[3]。PVP是酚类物质的专一性吸附剂，在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的保护剂[4]16-17，防止褐变的效果比无机吸附剂活性炭好。（3）培养条件以低温遮光处理效果较好，光温两个因素中，凹叶厚朴对光敏感，遮光能有效抑制褐变，这可能是在黑暗条件下，阻断了酚类物质的生化合成途径，降低了酚类化合物的含量，同时抑制了PPO活性，减轻了酚类物质的氧化有关[

8、4]18，光照会提高PPO的活性，促进酚类物质的氧化。温度对褐变造成的影响有两个方面的原因：较低的温度有利于伤口的愈合；另外，会降低PPO的生物活性，从而减轻褐变[2]63。（4）液体浅层静置培养10d后转