rnai抑制nek293细胞tgfβ1表达的研究

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1、RNAi抑制NEK293细胞TGFβ1表达的研究ok3RNA及蛋白的表达,细胞生长试验和流式细胞观察转染前后细胞周期及细胞凋亡的变化.另设一无意义RNA载体质粒为阴性对照.结果:siRNA转染效率70%,特异性siRNA对TGFβ1mRNA及蛋白的表达具有抑制作用(P>0.05),实验组细胞生长受到抑制、凋亡增加(P>0.05).结论:应用RNAi技术可明显抑制TGFβ1的表达,并高效的抑制NEK293的生长、诱导其凋亡.【关键词】转化生长因子β1;肾纤维化;RNA干扰0引言肾纤维化是肾脏多种损伤,如创伤、缺血、肾移植术后慢性排异反应及尿路梗阻等修复的共同转归.长期以来

2、,肾纤维化被描述为不可逆的静止性瘢痕组织,但近年来的研究认为纤维化实际上是一个动态过程,其特征为细胞外基质(ECM)迅速重建和长期的成纤维细胞激活[1],已知的主要效应细胞为成纤维细胞、肾间质细胞等.体外研究[2]表明,转化生长因子β1(TGFβ1)是肾间质细胞的主要调控因子.本研究应用TGFβ1特异性小干扰RNA(siRNA),以质粒载体转染大鼠肾间质细胞NEK293,观察特异性siRNA对TGFβ1的表达,NEK293细胞周期及凋亡的影响.1材料和方法1.1材料HEK293细胞(美国Clontech公司);Lipofectamine(美国Gibco公司);RTPCR试剂盒(

3、日本TaKaRa公司);化学发光试剂,(美国SantaCruz公司);噻唑蓝显色剂(MTT)、碘化丙啶(PI)荧光染料、TritonX100打孔剂(美国Sigma公司);DOSPER脂质体(美国Roche公司);荧光显微镜(德国Opton公司);TECANsunrise型自动酶联免疫检测仪,coulterEpicsXL流式细胞仪,LS6500液闪计数仪(美国Beckman公司).1.2方法1.2.1特异性siRNA设计及载体的构建候选siRNA序列通过BLAST工具搜索,去掉与人类RNAs同源性的靶序列,最后选取3个siRNA.根据pSilencer3.1H1质粒载体使用说明,将编

4、码siRNA的双链互补DNA片段插入该载体的BamHI/HindⅢ位点之间以制备发夹cDNAs[3].表达这3种siRNA的重组质粒分别命名为psiRNA1,2,3.以BamHI和HindⅢ酶切后电泳观察酶切特异性片段的大小,并对纯化的siRNA片段进行DNA测序分析.另合成一不针对任何基因的无意义片段作为对照.1.2.2细胞培养及转染HEK293细胞以含100mL/L灭活小牛血清的RPMI1640培养液,于37℃,50mL/LCO2,饱和湿度培养,2d换液1次.取对数生长期细胞进行实验.按lipofectamineTM2000脂质体转染法,将5μgpsiRNA(13)和无意义

5、对照质粒转染到HEK293细胞中,6h后更换正常培养基,12h后荧光显微镜及流式细胞仪观察转染效率.1.2.3RTPCR检测psiRNA1,2,3三个实验组及对照组分别收集细胞(细胞总数为1×107个)按Trizol试剂操作步骤提取总RNA,选用一步法RTPCR试剂盒.具体参数及条件根据引物的Tm值和扩增片断的大小进行调整.1.2.4TT比色实验1×104HEK293细胞接种于96孔培养板,37℃,50mL/LCO2,饱和湿度培养1d.按实验要求分别在细胞中加入终浓度为200nmol/L的siRNA,中止培养4h前加入MTT,应用酶标仪进行检测.检测490nm波长处的吸光度A值

6、,计算细胞增殖抑制率:增殖抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%.1.2.6细胞凋亡检测3mL培养液含5×105细胞培养于6孔板,用预冷的700mg/L乙醇固定,4℃过夜,PI(50mg/L)染色,分析亚二倍体峰.调整细胞密度为5×106/mL,取1mL细胞悬液,1000r/min4℃离心10min,重复2次,将细胞重悬于200μL结合缓冲液,加入10μL膜连蛋白Ⅴ(AnnexinV2FITC)和5μL碘化丙锭(PI),避光室温反应15min,加入300μL结合缓冲液,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.1.2.7转染效率的检测试剂盒中提供带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体作为

7、阳性对照用以监测转染效率.按说明书转染,24h后收集细胞,PBS洗涤后固定在20g/L多聚甲醛中,流式细胞仪检测.统计学处理:以SPSS11.0软件进行分析.组间差异比较采用方差分析及LSDt检验,P<0.05为差异具有统计学意义.2结果2.1siRNA转染效率流式细胞分析显示,几乎所有的细胞都摄取了GFP的绿色荧光.由于siRNA分子远小于质粒分子,故转染siRNA时转染效率应大于70%(图1).A:siRNA1组;B: