微生物基因工程第六(2)

《微生物基因工程第六(2)》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第六章外源基因的表达6.1基因表达的机制6.2基因表达的调控元件6.3影响外源基因表达的因素6.4外源蛋白的融合表达及分泌表达6.5大肠杆菌基因表达系统6.6酵母基因表达系统6.7哺乳动物基因表达系统6.8基因表达产物的检测与分离纯化6.1基因表达的机制6.1.1外源基因的起始转录6.1.2mRNA的延伸与稳定性6.1.3外源基因mRNA的有效翻译6.1.4表达蛋白在细胞中的稳定性6.1.5目的基因沉默6.1.1外源基因的起始转录选择可调控启动子和相关调控序列原核生物：诱导型启动子和组成型启动子诱导型启动子：lac、trp、PR、PL、tac组成型启动子：T7真核生物：启动子和增强子

2、6.1.2mRNA的延伸与稳定性外源基因起始转录后，保持mRNA的的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。在构建表达载体时，尽量避免衰减子序列、加入抗终止序列，转录终止序列、poly(A)掺入位点（真核生物）。选择RNase缺失受体菌（原核生物）。6.1.3外源基因mRNA的有效翻译在原核细胞中影响翻译的起始因素有：起始密码子、核糖体结合位点（SD序列）、起始密码与SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5′非翻译序列和蛋白质编码区的5′端序列等。外源基因mRNA有效翻译须考虑的基本原则原核生物真核生物6.1.4表达蛋白在细胞中的稳定性外源基因表达

3、产物能否在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白水解酶水解是基因有效表达的一个重要因素。避免外源基因表达蛋白降解的措施：(1)构建融合蛋白表达系统(2)构建分泌蛋白表达系统(3)构建包涵体表达系统(4)选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统6.1.5目的基因沉默目的基因沉默(genesilencing)：某种原因导致外源基因不能正常表达主要表现在转基因动物和植物中位置效应的基因沉默转录水平的基因沉默转录后水平的基因沉默6.2基因表达的调控元件6.2.1启动子6.2.2增强子6.2.3终止子6.2.4衰减子、绝缘子和反义子6.2.1启动子启动子定义、特征（1）序列特异性（2）方向性（3）位置特性

4、（4）种属特异性原核生物启动子真核生物启动子6.2.2增强子增强子(enhancer)：能增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列，由多个元件组成，每个元件可以与一种或多种转录调控因子结合。增强子的特性：(1)双向性(2)重复序列(3)增强子行使功能与所处位置无关(4)特异性(5)增强子与同源或异源基因相连时均有调控功能6.2.3终止子终止子(terminator)本征终止子不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的结构区内实现终止作用。依赖型终止子需要其他蛋白辅助因子才可在特殊的结构区内实现终止作用。6.3影响外源基因表达的因素6.3.1外源基因的表达效率6.3.2表达质粒的拷贝数和稳定性6

5、.3.3表达产物的稳定性6.3.4工程菌的培养条件6.3.5细胞的代谢负荷6.3.1外源基因的表达效率启动子的强弱核糖体结合位点的有效性SD序列和起始密码子AUG的间距密码子组成6.3.2表达质粒的拷贝数和稳定性6.3.3表达产物的稳定性组建融合基因，产生融合蛋白产生可分泌的蛋白外源蛋白可以在宿主细胞中以包涵体形式表达选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性6.3.4工程菌的培养条件优化发酵过程工艺因素如选择合适的发酵系统或生物反应器生物学因素首先是与细菌生长密切相关的条件或因素，如发酵系统中的溶氧、pH值、温度和培

6、养基的成分等对外源基因表达条件的优化是提高外源基因表达产物的总量。外源基因表达产物的总量取决于外源基因表达水平和菌体浓度6.3.5细胞的代谢负荷外源基因在细菌中高效表达，必然影响宿主的生长和代谢，而细胞代谢的损伤，又必然影响外源基因的表达。合理地调节好宿主细胞的代谢负荷与外源基因高效表达的关系，是提高外源基因表达水平不可缺少的一个环节6.4外源蛋白的融合表达及分泌表达6.4.1基因融合表达外源蛋白的原因6.4.2基因融合的策略6.4.3外源基因在大肠杆菌中的分泌表达6.4.1基因融合表达外源蛋白的原因外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解通过与一特异性的蛋白质或其特异的结构域形成融合蛋

7、白，可使表达产物得到快速、有效的回收、纯化通过与特定的肽段进行融合表达，可以将表达的外源蛋白质定向地定位在宿主细胞的不同区位。通过同特定蛋白先形成融合蛋白，然后再通过体外切割去除融合部分，是获得天然蛋白的一种更可靠和可重复性的方法。通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，使外源蛋白在细胞内进行可溶性表达，防止包涵体的形成6.4.2基因融合的策略最简单的融合方式是将重组基因直接剪接于适当的信号肽序列之后将外源基因本身按阅读框架自我融合目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴(f