微生物研究法d组

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1、微生物研究法D組報告者：曾仁志報告日期：2005/9/19題目：(1)CO2、Sodiumbicarbonate和HEPESbuffer對培養基pH值的調控。(2)成立一個細胞學實驗室需要什麼需求。培養基pH值的變動對細胞造成的影響哺乳動物細胞最適生長的pH範圍為7.2~7.4，過酸或過鹼都會對細胞生長不良或造成傷害，故讓培養基的pH值穩定是相當重要。Forexample：ArticularChondrocytes(關節軟骨細胞)，主要的能量來源是透過糖解作用之無氧代謝，Pyruvate轉換成lacticacid，會迅

2、速酸化培養基而導致抑制細胞生理及代謝。GlucoseGlycolysisGlucose-6-phosphatePyruvateLacticacidpH↓CellCO2、Sodiumbicarbonate和HEPESbuffer對培養基pH值的調控培養基的pHbuffersystem最常用NaHCO3加入培養基中，以CO2來調整pH在適當之範圍(HCO3-+H+H2CO3CO2+H2O)。※細胞生長需要CO2的環境，然而在CO2incubator不斷的補充CO2下，培養基會越來越酸。加sodiumbicarbonate進

3、去，使HCO3-去抓住H+來平衡pH值。然而在細胞生長快速及carbonicanhydrase的存在下，培養基會酸化的更快，故以添加HEPES來穩固細胞生長最適之pH的環境。CO2、Sodiumbicarbonate和HEPESbuffer對培養基pH值的調控以HEPES當培養基之緩衝液之優缺點優點：對細胞毒性較小，適用於多種類型細胞的培養。(參見表一)盡可能避免光照缺點：長期暴露於光照下，會產生具細胞毒性之自由基。(但是只要避光保存便可避免，此問題較易解決。)參考資料表一、各種常用緩衝液及其使用範圍緩衝液適用pH值使

4、用上注意Formate3.0~4.5會溶解細胞膜上的蛋白質。Citrate3.0~6.2小心會與二價金屬離子結合。Acetate3.7~5.5容易揮發，可用冷凍乾燥除去。Phosphate5.8~8.0小心會與鈣離子結合沉澱，低溫下易結晶。HEPES6.5~8.5毒性較小多用在細胞培養。Tris7.1~8.9pH值受溫度影響很大。Carbonate9.7~10.7小心會與金屬離子結合沉澱。PhosphatebufferwithorwithoutCa2+PhosphatebufferwithoutCa2+：多應用於細胞培

5、養之沖洗。WithorwithoutCa2+?Why?PhosphatebufferwithorwithoutCa2+Phosphatebuffer與鈣離子結合沉澱的原因：溶液的pH值在溶液中，磷酸鹽是以三價的磷酸根（PO43-）、二價的磷酸氫根（HPO42-）和一價的磷酸二氫根（H2PO4-）存在，這三個離子會維持一個平衡的狀態，但是PO43-要在強鹼（pH值很大時）的情況下才會存在，所以在phosphatebuffer溶液中只可能以HPO42-及H2PO4-存在。HPO42-較會和鈣離子產生沉澱。在pH值7.4時會

6、有80%的HPO42-存在，較會和鈣離子產生沉澱；若pH值下降至5.4時，則有96%的H2PO4-的存在，這樣一來就減少產生磷酸鈣沉澱的機會。所以溶液pH值影響鈣磷沉澱很大，pH值較低時，發生沉澱的機會也較低。PhosphatebufferwithorwithoutCa2+成立一個細胞學實驗室的基本需求設計細胞實驗室之基本考量細胞培養最害怕的就是污染的問題，因此提供一個無菌的設備、環境及無菌操作技術是十分重要的。UV殺菌燈設計細胞實驗室之基本考量無菌操作臺滅菌器設計細胞實驗室之基本考量細胞培養室與其他工作室隔離，需有2

7、~3道門，要有緩衝區來更換鞋子與實驗衣。Airshower設計細胞實驗室之基本考量細胞培養箱、冰箱、桌上型離心機、顯微鏡等設備。Incubator冰箱細胞實驗室之基本配備離心機顯微鏡細胞實驗室之基本配備其他設備1.水浴槽2.液態氮3.-20℃、-80℃、4℃等冰箱。4.其他的視實驗需求而定。參考文獻FiskA.,PathakS.,(1969)HEPES-bufferedmediumfororganculture.Nature.224,1030-1031.WaldmanS.D.,CoutoD.C.,OmelonS.J.,

8、KandelR.A.,(2004)EffectofsodiumbicarbonateonextracellularpH,matrixaccumulation,andmorphologyofculturedarticularchondrocytes.TissueEngineering.10,1633-1640.