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1、肝癌组织中A2b腺苷受体的表达及其意义作者：项红军，窦科峰，王德盛，杨雁灵，刘正才，陈勇【关键词】肝肿瘤；受体,腺苷A2b；聚合酶链反应【Abstract】AIM:ToassessalignanttissuesandevaluateA2badenosinereceptorlevelinhepatocellularcarcinoma(HCC).METHODS:RTPCR反转录试剂盒购自invitrogen公司，Taq酶和DL2000购自宝泰克生物技术有限公司.1.2方法1.2.1免疫组织化学染色采用EnVision系统二步
2、法.脱蜡，水化组织切片.预处理组织切片，酶修复或热修复.滴加30g/LH2O2阻断内源性过氧化物酶，孵育10min.蒸馏水漂洗，置于PBS中10min.一抗孵育30min.PBS漂洗10minEnVision孵育30min.PBS漂洗10minDAB染色，光镜控制蒸馏水漂洗复染及封片.1.2.2arker，TBST洗膜，50g/L的脱脂奶粉封闭1h，加入A2b抗体(1∶200)，4℃封闭过夜，TBST洗膜，10min/次，共3次，加入二抗羊抗兔（1∶3000），室温封闭1h，TBST洗膜，10min/次，共4次，化学发光
3、法检测.1.2.3RNA提取及cDNA合成总RNA的提取依照TRIzol试剂盒说明书进行操作，所有的操作均在超净台中完成，分离出的RNA溶于DEPC水储存在-70℃中备用.RNA反转录过程由oligo(dT)20priming和ThermoScriptRTPCRSystem完成.将所有的样品稀释到1g/L.取3μL总RNA，1μLOligodT，2μLdNTP(10mmol/L)，6μLDEPC水，混合均匀，65℃，5min.再加入4μL5×cDNABuffer，1μLDTT(0.1mol/L)，1μLRnaseOUT，
4、1μLDEPC水，1μLThermoScript混合均匀，50℃，60min.再加热至85℃，5min.加入1μLRnaseH，37℃，20min，将样品放入-20℃保存备用.PCR反应体系如下：2.5μL10×PCRBuffer(MgCl2)，1.5μLMgCl，2μLdNTP，1μLβactin上游，1μLβactin下游,1.5μLcDNA模版,0.5μLTaq酶,15μLddH2O,总体积25μL..反应温度如下：94℃30s，57℃30s，72℃40s，25个循环，72℃5min4℃保存备用.1.2.4定量PC
5、R腺苷A2b受体的引物和探针来自ENSG00000170425(利用primerexpress软件产生).其上游引物为5′TCCATCTTCAGCCTTCTGGC3′,下游引物为5′AAAGGCAAGGACCCAGAGGA3′，荧光探针(FAM)为5′TGTGTCCCGCTCAGGTATAAAAGTTTGGTC3′.看家基因βactin来自AB115328，上游引物为5′GCCCTGAGGCACTCTTCCA3′,下游引物为5′GAAGGTAGTTTCGTGGATGCCA3′，荧光探针(FAM)为5′CCTTCCTTCC
6、TGGGCATGGAGTCCT3′.定量PCR过程由ABIPrism7700序列检测仪完成（PerkinElmer公司），实时PCR反应体系如下：5μL定量Buffer,0.75μL10mmol/LdNTP,0.5μL250mmol/LMg2+,0.5μL10μmol/L上游和下游引物0.6μL5μmol/LTaqman探针,0.25μLTaqPolymerase(83.35mkat/L),2μLcDNA模板，总体积25μL.95℃变性30s，60℃退火延长30s,反应50个循环.统计学处理：结果以x±s表示，配对资料采
7、用t检验.2结果2.1腺苷A2b受体的表达免疫组织化学染色显示肝癌组织肝细胞膜和胞质中有阳性表达细胞,呈黄色颗粒,正常组织中染色的阳性细胞较少或无(图1).2.2腺苷A2b受体蛋白水平表达A2b受体蛋白条带灰度值在肝癌组织中明显高于邻近正常组织(图2)，A2b受体蛋白水平相对于βactin水平在肝癌组织中明显高于邻近正常组织［(1.75±0.54)vs(0.77±0.13),P<0.01］.2.3腺苷A2b受体mRNA水平测定定量PCR结果显示肝癌组织中（3.05×106拷贝/gRNA）明显高于邻近正常组织(2.3
8、6×103拷贝/gRNA)(P<0.01）.3讨论在肿瘤的发生发展过程中,不断进行新生血管化是肿瘤的一个重要特征，腺苷受体的上调和过表达与局部组织的血管发生有着特定的联系，研究表明腺苷受体家族与肿瘤的发生有着潜在的密切联系［4］.但是A2b受体的作用机制仍未完全阐明，A2b受体分布在许多组织中，在腺苷浓度异常增
