低分子肝素对大鼠脑局灶性缺血再灌注后bcl2，bax表达的影响及保护作用论文

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1、低分子肝素对大鼠脑局灶性缺血再灌注后Bcl2，Bax表达的影响及保护作用论文高素玲，王大力，常莉莎，赵晓晶，张丽【摘要】目的：观察低分子肝素对大鼠脑缺血再灌注后不同时间点Bcl2,Bax表达的影响及保护作用.方法：①选用雄性SD大鼠54只，体质量280～330g.应用随机数字表法将大鼠分为3组：假手术组、缺血再灌注组和低分子肝素组，每组18只.②应用免疫组化方法测定海马CA1区神经元细胞凋亡基因Bcl2,Bax表达情况.③采用两样本均数的t检验对两组间数据进行分析.结果：大鼠54只均进入结果分析，缺血再灌注组大鼠脑缺

2、血再灌注6.freelo龄，体质量280～330g［华北煤炭医学院动物实验中心，许可证号scxk（冀）20050001］.动物饲养环境自然光照，环境安静，温度适中.应用随机数字表法将大鼠分为3组：假手术组、缺血再灌注组、低分子肝素组，每组18只.低分子肝素(速避凝，杭州赛诺菲圣得拉堡民生制药有限公司)；Bcl2,Bax试剂盒、PV6001(兔二步法)、DAB显色剂、PBS试剂盒、APES粘片剂、EDTA修复液（北京中杉金桥生物技术有限公司）；苏木素、伊红、多聚甲醛和无水乙醇（本院病理教研室）；CMIAS真彩医学图像

3、分析系统(北京航空航天大学研制)；Olympus摄像显微镜(日本)；KPJ1烤片机(天津)；Leica石蜡切片机(德国)；LY3型切片机(上海)；微量液体加样器(上海)；数码温控微波炉(天津)；手术操作台(自制)；60℃～100℃水育箱(上海).1.2方法1.2.1模型制作采用改良Longa等［2］法制作大鼠右侧大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血再灌注模型.造模成功评估标准：①提尾时大鼠左前肢内收屈曲；②爬行时向左侧倾倒或按逆时针方向转圈;③右眼Horner征.1.2.2分组干预假手术组只游离右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉.

4、缺血再灌注组和低分子肝素组均建立大鼠右侧大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血再灌注模型.缺血2h后分别腹腔注射生理盐水1mL和皮下注射低分子肝素（200U/kg，用生理盐水稀释至1mL），两组均于缺血2.5h后开始再灌注6，12，24h，每个时间点取6只进行观察.1.2.3标本采集与检测将大鼠在各个时间点经腹腔注射100mL/L水合氯醛（0.003～0.004mL/g）再次麻醉，固定四肢及头部，迅速打开胸腔暴露心脏，剥离心包，将灌注针头自左心室插入到升主动脉，固定针头，剪开右心耳，依次灌注生理盐水100mL，40g/L多聚甲醛(0.

5、01mol/LPBS，pH7.4)500mL，待肝脏变白变硬后，将大鼠断头取脑，去除嗅球、脑干、小脑，以视交叉和其后4mm处两点冠状切片，取脑组织块，置4℃，40g/L多聚甲醛24h，常规脱水，包埋制成蜡块.石蜡切片厚度5μm，40℃水浴展开，用经粘片剂处理过的载玻片捞片，置于60℃烤箱中烘烤1h，再行HE染色和免疫组织化学染色.石蜡切片脱蜡至蒸馏水，EDTA微波热修复，维持煮沸10min，冷却至室温，3mL/LH2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶10min，用PBS洗3次，每次洗3min，正常山羊血清封闭内源性抗原20min

6、，滴加适当稀释（1∶100）的一抗，40℃过夜，PBS洗3次，每次洗3min，滴加抗兔HRP多聚体，在37℃放置40min，DAB显色镜检控制.应用医学图像分析系统及摄像显微镜记录Bcl2，Bax阳性细胞数，阳性部位位于细胞质，计数4个不重复高倍视野(×200)中阳性细胞数目，数值用x±s表示.1.2.4主要观察指标观察各组不同时间点Bcl2,Bax阳性细胞数.统计学处理:采用SPSS11.5软件进行统计处理，结果以x±s表示，采用两样本均数的t检验对两组间数据进行分析.2结果2.1实验动物数量分析纳入大鼠54只，均

7、进入结果分析，无脱失值.2.2低分子肝素对大鼠脑缺血再灌注Bcl2,Bax表达的影响假手术组Bcl2,Bax中均有微弱表达.低分子肝素组的缺血侧海马CA1区Bcl2在神经元内的表达随着再灌注时间的延长逐渐增强，再灌注后6,12,24h,低分子肝素组的Bcl2表达量明显增多（图1），与缺血再灌注组比较具有显著的统计学意义(t分别为-5.190,-15.005,-14.116,.freelain等［7］通过对局灶性脑缺血再灌注大鼠应用LMCAO2.5h再灌注6，12，24h缺血侧海马区Bax的表达显著增加，Bcl2表

8、达不明显，给予低分子肝素处理后，Bax表达减少，Bcl2表达增加，说明应用低分子肝素治疗后能抑制Bax的表达，增加Bcl2表达，改善缺血再灌注损伤，提示低分子肝素可能是通过减少Bax蛋白的表达、上调的Bcl2表达，从而减轻神经元的损伤及凋亡，起到脑保护的作用.【