药学毕业论文--克拉维酸发酵过程变温控制的研究

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1、克拉维酸发酵过程变温控制的研究作者：朱校适冯涛王永红，黎亮张嗣良刘新山曹斌【摘要】本文在50L自动控制发酵罐上进行了克拉维酸发酵过程温度控制优化试验。分别将发酵过程全程温度控制在24℃、26℃、28℃下进行发酵时，通过对发酵各阶段的重要参数的对比分析，发现温度对棒状链霉菌的生长和代谢有重要影响，降低对数生长期发酵温度可明显缓解前期供氧不足的矛盾。进而通过对发酵过程的变温控制，使克拉维酸的产量由原来3950mg/L提高到4500mg/L，增产11.5%。【关键词】克拉维酸；发酵；变温控制；溶氧ABSTRACTThepres

2、entworkreportedoptimizationoftemperaturecontrolstrategyintheprocessofclavulanicacidfermentationon50Lfermentor.Fermentationsrununderisothermalwayinfullprocessesat24℃,26℃and28℃respectively.Theprofoundparametersinvolvedinmetabolismwerecomparedandanalyzedbydifferen

3、tphases.ItwasfoundthatthetemperaturegreatlyaffectedthegrowthandmetabolismofStreptomycesclavuligerus;lower9temperatureevidentlyincreasedthedissolvedoxygenlevelattheidiophase.Finallyanewtemperaturecontrolstrategywasadoptedandclavulanicacidproductionincreasedby11.5

4、%.KEYWORDSClavulanicacid;Fermentation;Temperaturecontrol;DO　克拉维酸(clavulanicacid，CA)是一种β内酰胺酶抑制剂，本身抗菌活性很弱。但当CA与β内酰胺类抗生素制成复方后可以增强β内酰胺类抗生素的抗菌活性和增大其抗菌谱，有助于克服β内酰胺类抗生素耐药性。CA是由棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)产生的一种次级代谢产物。在研究中我们发现CA发酵在进入对数生长期后溶氧易于跌零，影响CA生物合成。据文献报道温度对棒状

5、链霉菌生长和CA合成都有影响［1～3］。本文以工业生产菌种为对象，考察温度对CA发酵的影响并研究如何通过变温控制提高CA的发酵水平。1材料与方法1.19菌种棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)F21，由山西威奇达制药厂提供。1.2试剂硫酸氢四丁基胺、NaH2PO4·2H2O、乙腈(色谱级)、NaOH、CA标准品。1.3培养基(1)种子培养基主要成分为甘油、豆粉、糊精；pH8.0，121℃灭菌30min。(2)发酵培养基主要成分为甘油、豆粉、糊精、吗丙酸、FeCl3、ZnCl2、MgSO4、Mn

6、SO4、CuSO4、CaCl2、FeSO4，pH7.0，121℃灭菌25min。1.4培养(1)种子培养9在无菌的条件下，向装量为600ml/3000ml三角瓶中接入3.5ml孢子液。在25℃，230r/min条件下摇床培养72h，然后转入二级种子罐培养48h。(2)发酵培养在无菌条件下，从种子罐取1L种子液接入装量为35L发酵液的50L罐中进行培养。采取分批补料工艺，从20h左右开始补加甘油，用20%氨水自动调控pH在7.0±0.05范围之内。以溶氧30%作为最低限制性溶氧值，每间隔8h取样进行离线参数测量，包括pH、

7、菌浓、黏度等参数并涂片观察菌丝状态；从31h开始进行效价测量。发酵最后阶段每4h取样一次。当大比例的菌丝开始自溶、溶氧回升、效价停滞时放罐。1.5测定方法(1)菌体浓度的测定采用菌丝占溶液体积的百分比表示。取10ml发酵液反复的离心(3500r/min，10min)和洗涤，直到离心后的固含物中不含有杂质为止，记下菌丝的体积百分比作为菌体浓度；发酵液第一次离心得到的上清液留用。(2)尾气分析采用生物尾气分析仪(PS6000型，购自重庆哈特曼测量仪器有限公司)对二氧化碳释放速率(CER)和摄氧率(OUR)，呼吸商(RQ)进行

8、数据采集。(3)克拉维酸测定9采用高效液相色谱法。色谱柱SBC18(4.6mm×100mm，3.5μm)，流速1.5ml/min，温度33℃，注射量20μl；检测波长210nm，压力60～100bar。流动相为10mmol/L硫酸氢四丁基胺∶甲醇(100∶15，V/V)，pH2，硫酸氢四丁基胺需要用0.45μm有机