低渗透油藏微生物驱油试验研究

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1、低渗透油藏微生物驱油试验研究指导教师：褚庆忠课题组长：刘志文课题组员：杨震、毛雨涵、蒋志宇项目研究步骤该项目主要分为两个阶段：一、培养细菌，并筛选出能够耐高温高压的产多糖的细菌，并对菌种进行保藏。对所得细菌进行探索性研究。二、利用所筛选出来的菌种，进行生物驱油实验。第一阶段细菌的制备与探索性研究一、研究的基本内容，拟解决的主要问题1.研究的基本问题本研究主要从海水中培养以及筛选产多糖的细菌，通过分离纯化，以及菌种的初筛、复筛、菌种的鉴定，筛选出能够耐高温高压的产多糖的细菌，并对菌种进行保藏。并对筛选的高温高

2、压的产多糖的细菌进行探索研究。2.拟解决的主要问题通过从海水中筛选富集细菌，来筛选出能够耐高温高压的产多糖的细菌，并通过鉴定辨别菌种，并进一步探索出筛选出的耐高温高压的产多糖的细菌的应用价值。微生物获取过程微生物的筛选测定含糖量，筛选最适微生物。测试所选微生物性质并记录。第一阶段工作成果产多糖菌的初筛分别从秦皇岛浅水湾和燕大食堂下水道污泥中取样，将样品经过梯度稀释后分别涂布于LB固体培养基上，培养2天后观察发现两种菌源的平板上都长满了菌落，如下图：产多糖菌的复筛对初筛分离的纯种菌接种到液体发酵培养基中，分别

3、对应编号1-7号，经过摇床震荡培养4天，取出1-7号的锥形瓶，观察发酵液的粘稠情况和多糖颜色以及沉淀情况。具体结果如右表：编号颜色沉淀物粘度1无色无不粘2淡黄微量不粘3暗红很多粘稠4淡黄微量微粘5暗红很多粘稠6浅褐色多粘稠7淡黄微量微粘仔细观察菌落团中的不同菌落，选定外观比较粘稠的菌落，经过镜检确定各个菌落的形态特征，用接种针挑出形态不一致的细菌，挑选的菌落多为无色菌落且在挑取的情况下能形成连续的拉丝，在LB培养基平板上划线培养，重复两次，得到纯种。编号分别为1、2、3、4、5、6、7如下图：标准曲线：苯酚

4、-浓硫酸标准曲线的制备取1.9g烘干的分析纯葡萄糖溶于1L蒸馏水，制成1.9mg/mL的标准溶液。然后取标准溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL分别稀释到100mL，制成浓度为19μg、38μg、57μg、76μg、95μg、114μg、133μg、152μg/mL的溶液，取各溶液0.6mL置于干燥的洁净试管中，加入50mg/mL的苯酚溶液1.2mL，混合均匀，迅速加入6.0mL浓硫酸，混合均匀，室温静置30min，于波长490nm测定吸光度，蒸馏水作为空白管对照。以糖浓度为横

5、坐标，吸光度值为纵坐标得标准曲线，根据该曲线可以测定寡糖或多糖中的糖含量。待测样品多糖的测定与计算分别取1-7号锥形瓶发酵液1mL，稀释100倍，取稀释液0.6mL，加入50mg/mL的苯酚溶液1.2mL，混合均匀，迅速加入6.0mL浓硫酸，混合均匀，室温静置30min，于波长490nm测定吸光度，蒸馏水作为空白管。读出吸光度数值之后于标准曲线上即可查出对应的糖浓度。经过读数可得1-7号稀释样品的平均吸光度值依次为0.213、0.408、0.958、0.423、0.882、0.647、0.502。在标准曲线

6、上查询可知1-7号稀释样品的葡萄糖浓度分别为31.93、42.38、148.72、45.64、125.75、82.23、52.64μg/mL。因此1-7号发酵液中的多糖浓度依次为3.29、4.24、14.87、4.56、12.58、8.22、5.26mg/mL。以下是所用分光光度计型号：由观察可知3号和5号颜色最深且发酵液粘稠，再由以上测定数据可知3号发酵液中多糖含量最大，由此可以知道3号菌株产多糖量最大，最符合实验目的。菌种初步鉴定菌种菌落形态观察对经过LB平板筛选到的3号纯种菌株进行形态观察得到如下结果

7、：项目形态干湿表面透明度高度黏度颜色边缘结果杆状湿光滑不透明平滑粘稠乳白色不整齐菌种生理生化特征分析革兰氏染色实验菌株3号经过革兰氏染色后显微镜下观察，菌体为杆状，呈紫色，故为革兰氏阳性菌。如下图：淀粉水解实验将菌株3接种到淀粉水解培养基上，37℃下培养24h后，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液，菌苔周围出现无色透明圈，所以菌株3的淀粉水解试验呈阳性，能产生胞外淀粉酶。石蕊牛奶实验将菌株3接种到石蕊牛奶培养基中，35℃下培养36h，试管底部变白，所以菌株3能还原石蕊。甲基红实验将菌株3接入到甲基红培养基中，

8、37℃下培养48h，加入甲基红指示剂2滴，培养基变黄，故菌株3的甲基红试验呈阴性，葡萄糖作碳源不能产生有机酸，甲酸、乙酸、乳酸等等。吲哚实验将菌株3接入到蛋白胨水培养基中，37℃下培养48h，加入指示剂后，在乙醚和培养基之间没有产生红色环状物，故菌株3不产生色氨酸酶，不能产生吲哚，呈阴性。V-P实验将菌株3接入到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃下培养48h，加入指示剂后培养基出现无红色现象，故菌株3的V-P试验呈阴