p物质对大鼠垂体前叶细胞游离ca2+影响的研究论文

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1、P物质对大鼠垂体前叶细胞游离Ca2+影响的研究论文【摘要】目的：探讨SP是否影响培养的大鼠AP细胞［Ca2+］i，在第二信使信息转导途径上进一步阐述SP产生生物学效应的机制。方法：原代培养成年雌性S-D大鼠的AP细胞48h，加入SP孵育不同时间，采用Fura-2/AM检测［Ca2+］i。结果：当SP浓度为100nmol/L，孵育时间由10min增加到30min时［Ca2+］i增加，但孵育时间为40min、50min时，［Ca2+］i呈现减少趋势，即最大反应的孵育时间为30min。当孵育时间为20min、30m

2、in、40min、50min时.freelol/L、369±51nmol/L、358±24nmol/L、239±36nmol/L，与10min（117±17nmol/L）相比较，呈显著性差异(P＜0.05)。结论：通过Fura-2/AM可精确反映［Ca2+］i,SP兴奋AP细胞SPR后可通过Ca2+来完成其部分的生物学效应，说明了SP对生殖轴（下丘脑-垂体前叶-卵巢/睾丸）有调控作用。【关键词】P物质Ca2+垂体前叶Fura-2/AMP物质（SP）通过垂体前叶（AP）的P物质受体（SPR）产生作用。作为第二信

3、使的钙离子可调控细胞内许多生理功能，如肌肉收缩、凝血过程、AP、神经冲动、分泌功能等。但SP作用于AP细胞其［Ca2+］i是否有变化的研究却很少，尤其是SP对下丘脑-垂体-性腺轴的调控机理尚不十分清楚。Fura-2/AM是80年代发现的第二代荧光探针,是目前被公认测量［Ca2+］i的一个良好指示剂，因此，本实验利用Fura-2/AM对培养的大鼠AP细胞的［Ca2+］i进行检测，探讨SP的作用机制。1材料与方法1.1实验试剂DMEM:美国GIBCO公司；胎牛血清：天津生物技术公司；1：250胰蛋白酶：美国Amr

4、esco公司；SP：美国Sigma公司；Fura-2/AM：美国Sigma公司；粉剂,用DMSO溶解稀释成1mmol/L,储存于冰箱内备用。1.2实验方法1.2.1AP细胞培养成年雌性大鼠24只，体重230～260g,于间情期清醒状态下断头，无菌取出AP，剪成碎块，加0.25%胰酶消化25min，两次，过钢网，离心弃上清，加DMEM使细胞悬垂并分散，进行细胞计数，调整细胞密度至1×106个细胞/ml，制成细胞悬液，将悬液接种到24孔培养板中，1ml/孔，孵育48h。1.2.2加入SP实验中设立：①组为空白对照

5、组（3孔），每孔加入1mlKHB缓冲液。②组为SP组（15孔，3孔为一时间段组），每组加入1mlKHB和100nmol/LSP的混合液孵育，调整孵育时间为10min、20min、30min、40min、50min，以10min组为对照组。1.2.3Fura-2/AM负载各组孵育完毕后加入含5μmol/LFura-2/AM，0.2%小牛血清的KHB缓冲液1ml温孵40min，弃缓冲液，用KHB缓冲液冲洗2～3次，置于自制浴槽中，在倒置显微镜下观察荧光强度。1.2.4［Ca2+］i的测定采用阳离子测定系统和软件分

6、析系统,测定加SP前后单个AP细胞内钙离子荧光强度的变化。激发光波长分别为340nm和380nm，发射波长为505nm，由下列公式计算胞内［Ca2+］i,［Ca2+］i=Kd×(Sf2/Sb2)×［(R-Rmin)/(Rmax-R)］。式中Kd生理条件下为224nmol/L；R是实验观察到的荧光比值(F340/F380)；Rmax是胞内Fura-2/AM全部为Ca2+饱和时的荧光比值,通过加入钙离子释放剂Ionomycin20μmol/L测得；Rmin为Fura-2/AM完全游离，未与Ca2+结合时的荧光比值

7、,通过加入EGTA20mmol/L测得；Sf2/Sb2则为Fura-2/AM在无Ca2+以及与Ca2+结合达饱和状态时，Fura-2/AM在380nm处的荧光强度。细胞的自发荧光在没有负载Fura-2/AM时测定，计算Ca2+浓度之前减去细胞自发荧光和背景荧光。1.3统计学处理数据以均值±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异显著性指标，P＜0.01为差异极显著性指标。2结果当SP浓度为100nmol/L，孵育时间为10min、20min、30min时，［Ca2+］i随着时间的增加而升高；而孵

8、育时间增加到40min、50min时，［Ca2+］i呈现减少趋势。孵育时间为10min时［Ca2+］i为117±17nmol/L，其他孵育时间与之相比较，呈显著性差异(P＜0.05)。测定结果见表1。表1孵育时间与［Ca2+］i变化的关系（略）注：与10min组比较，*P＜0.05,**P＜0.01。3讨论20世纪80年代Berridge等人向装有胰脏细胞的介质中加入IP3时，测得Ca2+从胞内Ca