低频低强度超声波诱导白血病细胞株k562凋亡的研究

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1、低频低强度超声波诱导白血病细胞株K562凋亡的研究作者：马燕，陈宝安，吴巍，姜藻，钱梦［摘要］　　目的：研究低频低强度超声波诱导白血病细胞株K562凋亡的作用及其机制。方法：取对数生长期的K562细胞，分成实验组和对照组，用MTT法计算细胞存活率，流式细胞仪判断细胞凋亡，瑞氏染色和透射电镜观察细胞照射后有无出现凋亡，分光光度法检测照射前后K562细胞Caspase3的活性改变。结果：超声照射各组间细胞存活率与对照组相比有统计学差异，但组间无差异；瑞氏染色光镜下可见0.03ethodsK562cellsinlogphaseentalgroup.Theintensityoflo-2respect

2、ively.Theexposuretimeeofperiods(6,24,48h)aftersonicationandthenumberofvitalcellsorphologyofapoptosisissionelectronmicroscopy.Thepercentageofapoptosisetry(FCM).TheactivationofCaspase3etricmethod.ResultsTheabsorbancevalueofMTTdecreasedsignificantlyafterexposure.Thehighestapoptosisembraneblebbing,chro

3、matincondensation,nuclearfragmentation,andapoptoticbodyformation.FCMrevealedthatthepercentageofapoptosisofcellsincontrolgroup,in0.03TT购于Sigma公司，annexinⅤ购于BD公司，Caspase3试剂盒购于南京凯基生物公司（进口分装），Bcl2/Bax试剂盒购于上海生工生物工程有限公司。　　1．2方法　　1．2．1细胞培养　　K562细胞接种于含10%小牛血清的1640培养液中，置于37℃、5%的CO2培养箱中，每2～3d传代1次，试验时取对数生长期细胞。

4、　　1．2．2超声照射　　将处于对数生长期的K562细胞取出，离心后置24孔培养板中，RPMI1640培养液重悬，调细胞浓度为5×105ml-1。分成对照组与实验组，实验组选取不同声强（0.03、0.10、0.25TT法计算细胞存活率　　将不同照射组以及对照组的细胞取出，分别计数，培养液稀释至2×105ml-1，置于96孔板中，每孔100μl；每组设3个复孔，向每孔加入MTT液10μl（浓度为5μg・ml-1），于37℃、5%的CO2培养箱中孵育4h，1500r・min-1平板离心10min；弃上清后加入二亚甲砜（DMSO）100μl・孔-1，振荡1

5、0min，待沉淀完全溶解后于550nm处在酶标仪上测吸光度（A）。按下式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=A实验孔/A对照孔×100%。　　1．2．4流式细胞仪检测　　收集不同照射组和对照组K562细胞1×106个，冷PBS洗涤2遍后，用50μｌ1×annexin结合缓冲液悬浮细胞，加annexinⅤFITC5μｌ，室温避光放置10min,再加PI10μｌ,混匀后室温避光放置5min，冷PBS洗涤1遍，加300μｌ1×annexin结合缓冲液重悬细胞后，立即在流式细胞仪(BectonDickinson)上检测，以annexin+/PI-判断为早期凋亡,annexin+／PI+判断为晚期凋亡。

6、　　1．2．5Caspase3的检测　　收集细胞，用PBS洗涤细胞2次，2000r・min-1离心5min，收集细胞（3～5）×106ml-1，用50μｌ冰冷的LysisBuffer悬浮细胞，置冰上20min；4℃10000r・min-1离心3min，把离心上清转移到新的离心管中，并放置冰上；标准曲线法测定蛋白浓度，吸取50μｌ含50～200μg蛋白的细胞裂解上清；再加50μｌ的2×反应液，再加5μｌCaspase3底物，并避光孵育4h，用酶标仪或分光光度计在λ=405nm或400nm处测定其吸光值；通过计算OD试验组/OD对照组值确定凋亡组的Caspase3活化

7、程度。　　1．2．6瑞氏染色　　将干燥好的玻片平置染色架上，滴加染液（Ⅰ液）3～5滴，使其迅速盖满玻片，1min后滴加等量的缓冲液（Ⅱ液），轻轻摇动玻片使染液充分混合，20min后用流水冲去染液，待干，置于显微镜下观察。　　1．2．7透射电镜观察　　收集不同照射组的细胞，移入10ml玻璃离心管中，加4℃预冷的PBS(0.01mol・L-1，pH7.2)至10ml，用吸管轻轻吹打均匀，2000r&