大鼠骨髓基质干细胞在与成骨细胞共育环境下的成骨特性论文

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1、大鼠骨髓基质干细胞在与成骨细胞共育环境下的成骨特性论文【摘要】目的在与成骨细胞(OB)共培养的条件下，观察大鼠骨髓基质干细胞(MSCs)的成骨特性。方法取自3月龄大鼠骨髓分离MSCs，扩增后以免疫组化法鉴定其表型，OB取自1日龄乳鼠，酶消化法获得。传代后的MSCs消化后分为MSCs/OB共培养组与普通培养组，观察MSCs的形态学变化及矿化能力，20d后半定量RTPCR方法检测两组骨钙素的表达，茜素红染色后显微镜下计数钙化结节。结果共培养组的MSCs形成的钙化结节数高于普通培养组(P0.01);共培养组的MSCs.free

2、ll,天津TBD公司)，乙二胺四乙酸(EDTA)、胰蛋白酶，Rna酶(Sigma)。Trizol试剂盒(RD)。GAPDH正链：5′GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA3′，反链：5′AGGCACCCAGGGTGATGCAA3′;骨钙素正链：5′GCCCTCTCCAAGACATATA3′，反链：5′CCATGATCACGTCGATATCC3′。1.2方法1.2.1OB的分离、扩增及鉴定取10只1日龄乳鼠颅盖骨,去除软组织,用PBS缓冲液多次漂洗,快速剪碎,用1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶于3

3、7℃消化10min。以1200r/min，离心5min,弃上清液,用含20%小牛血清培养液悬浮细胞并接种于培养瓶中,于37℃恒温、5%CO2及饱和湿度的细胞孵箱中培养。将骨组织块再用1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶于37℃消化20min,离心收集细胞,并接种于培养瓶中,以上步骤重复2次。每2～3d更换培养液,待原代细胞长至80%瓶底面积时以0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化,.freelin。取股骨和胫骨，剔去肌肉组织后用PBS冲洗3次，剪开骨头两端，露出骨髓腔。用DMEM培养液冲洗骨髓腔，反复2次。

4、冲洗后的液体过200目不锈钢网筛后，按1∶1的体积比加于淋巴细胞分离液上层以1200r/min离心20min，吸取液面交界处的单个核细胞。PBS悬浮细胞，以200r/min离心6min，反复2次。吸去上清液后用DMEM培养液悬浮细胞并调整细胞浓度为1×105/cm。接种细胞于塑料培养瓶，每瓶加细胞悬液5ml。接种72h后换液,此后每3～4d换液1次。待原代细胞长至80%瓶底面积时传代培养,以0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化,1瓶分2～4瓶的比例传代培养,反复进行扩增。倒置显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测CD

5、44、CD34及CD45。1.3共培养模型的建立与分组利用复合培养体系将OB和MSCs培养在培养液以及其中的大分子蛋白可以相互交流而细胞间不相互接触的培养板内，其间的隔膜孔径为0.4μm。培养上室内接种OB，培养下室内放置经处理的盖玻片并接种MSCs。分共培养组、普通培养组2组，每组于同一培养板重复12孔。1.4效应指标的检测培养第20天时，各组均取6孔MSCs消化后进行裂解，测定骨钙素RNA浓度，取2μg总RNA进行反转录，反应体系含0.5μg/μlOligodT2μl，10mmol/LdNTP1.5μl，40U/μlR

6、nasin1μl，200U/μlMMLVRT酶1μl，及buffer共25μl,37℃反应60min。取2.5μlcDNA作为模板于25μl反应体系中进行PCR。PCR条件：94℃预变性5min;变性：94℃，40s，退火：58.6℃35s，延伸：72℃，45s，32循环;72℃7min后终止反应，4℃冷却。产物取10μl于1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化已锭染色，利用凝胶成像系统(BioRadGelDoc2000)进行光密度扫描，比较目的基因平均光密度值(A值)。余6孔进行茜素红染色并计数钙化结节。1.5统计学处理采用S

7、PSS11.5软件进行t检验。2结果2.1MSCs的形态学观察原代初贴壁的MSCs呈成纤维细胞外观，贴壁细胞逐渐呈现集落生长，原代培养4～5d，贴壁细胞开始增殖并向三角形、多角形、梭形等分化，表面颗粒少。6～8d后，部分区域形成细胞团簇，细胞呈现成纤维细胞梭形外观，有较多突起，胞核明显，呈卵圆形，可见1～3个核仁，胞质丰富、清晰。生长期细胞分裂相多见，细胞突起互相联接。原代培养细胞密度为1×105/ml时，10～12d长满瓶底。融合成片的细胞排列有一定的方向性，呈旋涡状排列，细胞呈梭形或椭圆形等。传代细胞搁置2～4h迅速贴

8、壁，伸展，细胞呈均匀生长，细胞形态更加单一，5～6d铺满瓶底(图1)。图1原代MSCs形态学观察(×40)2.2MSCs表面抗原鉴定免疫组化检测结果显示细胞均一性较好,2代细胞均一性在90%以上,CD34、CD45表达为阴性,CD44表达阳性。2.3OB的形态学观察原代细胞培养1d后细胞贴壁展开，呈多角