基因治疗载体的研究现状

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1、基因治疗载体的研究现状【关键词】基因；治疗;载体基因治疗是一种新的治疗手段，可用于多种疾病的治疗，包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等.基因治疗通常是指将遗传物质（DNA或RNA）引入到患者的细胞中，以达到治疗疾病的目的的方法〔1～3〕.它是伴随着DNA重组技术的成熟而发展起来的新型的分子学治疗手段，是当今生物医学发展中的重大突破.1968年，美国科学家迈克尔·布莱泽首次在医学界提出了基因治疗的概念.1990年，美国科学家Anderson等进行了首例真正意义上的基因治疗临床试验，获得了初步成功〔4〕.在基因治疗过程中，基因导入系

2、统是最关键的技术.目前，在基因导入载体方面出现了两大主流，即病毒载体系统及非病毒载体系统.本文对基因治疗载体应用的原理、种类和研究现状进行了综述.1病毒载体外源基因进入细胞中通常需要运输工具，而病毒是在漫长的自然进化过程中存活下来的无细胞结构的最小、最简单的生命寄生形式.病毒通常可以高效率地进入特定的细胞，表达自身蛋白，产生新的病毒粒子，因此被改造的病毒首先成为了基因治疗的载体.病毒载体在基因治疗领域的应用广泛，约70%的治疗方案采用病毒载体〔5，6〕.病毒载体包括反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体及单纯疱疹病毒载体等.1.1反转录病毒载体反转录

3、病毒属于正链RNA病毒，可高效地感染许多类型的宿主细胞，并可稳定地整合到宿主细胞基因组中，是最先被改造且应用最广泛的基因治疗载体.反转录病毒基因组长度约为10kb，含有3个最重要的基因，即gag（编码核心蛋白），pol（编码反转录酶），env（编码病毒外膜蛋白）.基因排列顺序是5＇gagpolenv3＇，两端存在长末端重复区（LTRS），用于介导病毒的整合，env基因中含有病毒包装所必需的序列.另外，一些反转录病毒中存在原癌基因，其突变会引发癌变，当被整合到宿主细胞的原癌基因附近或插入到宿主细胞的抑癌基因中时也可引发癌变.构建反转录病毒载体多采用

4、鼠白血病病毒（MoMLV），其为嗜双性病毒，既可感染鼠细胞，亦可感染人细胞.反转录病毒载体的基本成分包括：1）必需的病毒基因组分，如LTRS、病毒的包装识别信号、翻译所需的剪接识别位点及poly（A）尾等;2）高效的治疗基因，如抑癌基因及自杀基因等;3）标记基因，用于筛选;4）其他质粒必要成分.在应用上，携带外源目的基因的反转录病毒载体需要包装细胞（如ProPak及PA317细胞系）才能成为成熟的重组假病毒粒子，其原因为在构建的复制缺陷型反转录病毒载体中，外源目的基因取代了病毒的必需基因，此时病毒只有借助包装细胞提供的反式作用蛋白，才能包装产生子代重组

5、病毒.这种子代重组病毒仅具备一次感染性，避免了在人体细胞间扩散感染，亦降低了病毒本身的致癌性及致病性.作为基因治疗载体，反转录病毒载体具有感染率高，可稳定整合表达，宿主范围广泛及对宿主毒性小等优点，但同时也存在仅感染正在分裂的细胞，可能致癌及包装外源DNA小（＜8kb）等缺陷.目前，在基础与临床研究中此类病毒载体多适用于间接体内基因治疗，特别是肿瘤的基因治疗.但重组反转录病毒的感染和转导效率较低，外源基因随机插入，可能导致突变.慢病毒载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒(HIV1)为基础发展起来的基因治疗载体,区别于一般的反转录病毒载体，对分裂细胞和非分裂细胞

6、均具有感染能力，转移基因片段容量较大，转染所需的病毒滴度可达（1～10）7×MU/L，目的基因表达时间长，不易诱发宿主免疫反应，对淋巴细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞、肌细胞和多种肿瘤细胞具有较高的转导效率〔7～10〕.1.2腺病毒载体腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒，在自然界分布广泛，至少存在100种以上的血清型.腺病毒基因组长度约为36kb，两端各有1个反向末端重复区，其内侧为病毒包装信号.腺病毒基因组上分布着4个早期转录元（E1,E2,E3,E4）承担调节功能，和1个晚期转录元负责结构蛋白编码.作为基因治疗的载体，腺病毒载体具有如下优点：1）基因

7、包装容量较大，因而可插入大片段外源基因，最多可达35kb；2）感染效率高，可高效地转导不同类型的人组织细胞，体外实验转导效率接近100%转导效率；3)可转导非分裂细胞；4)在细胞培养物中有高滴度的重组病毒产量；5）进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，因而安全性较高.第一代腺病毒载体为E1或E3基因缺失，缺失区插入外源治疗基因，但此型载体可引发机体产生强烈的炎症反应或免疫反应，且表达外源基因的时间较短.第二代腺病毒载体则另外让E2a或E4基因缺失，产生较弱的免疫反应，在载体容量和安全性方面亦有较大改进.第三代腺病毒载体缺失了全部的（无病毒载体）

8、或大部分腺病毒基因（微型腺病毒载体），仅保留反向末端重复区和包装信号序列，最多可